星豹蛛两个GST基因克隆、鉴定及其对溴氰菊酯胁迫的响应表达

焦丽亚琳, 赵萌萌, 王 美, 牛 越, 王 西, 李 锐

(山西农业大学植物保护学院, 太谷 030801)

蜘蛛是自然界陆地生态系统中最丰富的捕食性天敌,在害虫防控方面起到非常重要的作用(Lafageetal., 2020)。星豹蛛Pardosaastrigera隶属于蛛形纲(Arachnida)蜘蛛目(Araneae)狼蛛科(Lycosidae)豹蛛属Pardosa,是一种游猎型蜘蛛,是我国长江流域和黄河流域棉区的优势种蜘蛛之一。具有习性凶猛、捕食量大、寿命长等的特点,可以捕食蚜虫,黏虫Leucaniaseparata、棉铃虫Helicoverpaarmigera、玉米螟等的幼虫,在农田害虫防治中具有不可忽视的作用(李敏等, 2020)。近年来,随着杀虫剂使用种类的增加以及高剂量使用,不仅使害虫对杀虫剂的耐受性大大增强而产生了严重的抗性,而且对害虫天敌的生存造成了严重的威胁。星豹蛛又作为捕食优势种之一,其种群数量的多少直接影响到田间害虫的发生程度(李生才等, 2006)。因此,在农田生产中害虫天敌应着重得到保护和利用,研究星豹蛛对化学杀虫剂的解毒代谢,为害虫天敌的保护提供理论依据,也为天敌星豹蛛的绿色防控策略提供参考,降低该物种在杀虫剂影响下的生存危机。

谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferases, GSTs)是一种由多基因编码的多功能超家族解毒酶系,分布于动物、植物、细菌、真菌等几乎全部好氧生物体内,属于重要的Ⅱ相解毒酶(Sheehanetal., 2001; 刘婷, 2012)。Booth等(1961)在小鼠的肝脏中首次发现了GSTs,对昆虫GSTs的研究主要集中于GSTs对杀虫剂的解毒代谢能力(Enayatietal., 2005)。目前已知的GSTs参与杀虫剂抗性的机制主要有以下3种:第1种是GSTs催化谷胱甘肽(glutathione, GSH)与杀虫剂发生轭合反应,生成毒性较低的轭合物排出体外;第2种是通过消除反应;第3种是GSTs具有GSH过氧化物酶活性,可保护细胞免受杀虫剂诱导的氧化应激损伤(张邦贤, 2017)。此外,GSTs还参与生物体内激素合成和代谢、信号传导和胞间物质运输、抗氧化应答以及嗅觉行为等多种代谢过程(Xuetal., 2016; Durandetal., 2018)。目前,昆虫GSTs功能的研究在东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis、家蚕Bombyxmori、苹果蠹蛾Cydiapomonella较为深入(胡晓明, 2012; Zhangetal., 2014; 王炜, 2019)。蛛形纲中,在拟环纹豹蛛Pardosapseudoannulata、暗豹蛛Pardosalugubris、二斑叶螨Tetranychusurtica等物种中关于GSTs的研究已有报道(Wilczeketal., 2004; 王娟娟等, 2013; Liuetal., 2019)。有关星豹蛛GST基因的研究还未见报道。本研究在课题组已获得的星豹蛛转录组数据库的基础上(李萨丽, 2017),利用RT-PCR克隆得到星豹蛛2个GST基因的cDNA序列,生物信息学分析,并分析其时空表达模式以及在溴氰菊酯胁迫下的表达情况,初步推测基因的功能,为过表达基因功能的验证提供数据支撑,为后续深入研究GST基因的解毒代谢分子机理提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试星豹蛛

供试星豹蛛采自山西农业大学太谷校区农作站试验田,采集亚成蛛带回实验室在人工气候箱中饲养[温度(29±1) ℃,相对湿度75%,光周期16L∶8D],每头放入一个指形管中单独饲养,管内放入适当大小湿棉球保湿,以黑腹果蝇Drosophilamelanogaster和黄粉虫Tenebriomolitor作为主要食物,每隔1 d饲喂1次,1周更换1次指形管。

1.2 主要试剂和仪器

试剂:UNIQ-10柱式总 RNA 抽提试剂盒、零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司;HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix购自南京诺维赞生物科技股份有限公司;TransStart®FastPfu DNA Polymerase购自北京全式金生物技术股份有限公司;25 g/L溴氰菊酯(deltamethrin)乳油生产自拜耳作物科学(中国)有限公司。

仪器:MGC-300H人工气候箱(上海一恒科学仪器有限公司);T100TMThermal Cycler PCR仪(Bio-Rad);PowerPAac HC 164-5052琼脂糖凝胶电泳仪(Bio-Rad);AT126SL凝胶成像仪(Alpha Innotech);Mx3000PTM荧光定量PCR仪(Stratagene)。

1.3 星豹蛛GST基因的克隆

取星豹蛛雌雄成蛛各1头,在液氮低温环境下充分研磨至粉末状,利用UNIQ-10 柱式总 RNA 抽提试剂盒提取总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白仪检测总RNA浓度、纯度和完整性合格后,取5 μg 总RNA用于cDNA第1链的合成,-20 ℃保存。

从本课题组已有转录组数据库中获得编号为CL231.Contig1和Unigene20935的序列,使用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物(表1)。以上述合成的cDNA为模板,使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,PCR反应体系(50 μL): 模板cDNA 2 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 5×TransStart®FastPfuBuffer 10 μL,TransStart®FastPfuDNA Polymerase 1 μL, dNTPs(2.5 mmol/L) 4 μL, Nuclease-free Water 31 μL。PCR反应程序: 95 ℃ 1 min; 95 ℃ 20 s, x ℃ 20 s, 72 ℃ 40 s, 40个循环;72 ℃ 5 min。扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 生物信息学分析

使用在线网站NCBI ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)分析1.3节克隆的两个基因的开放阅读框(ORF),使用CD-search分析氨基酸的保守结构域,使用Expasy ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析所编码蛋白质基本的理化性质,用Expasy ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析所编码蛋白的亲疏水性,使用cell-PLoc2.0(http:∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)分析蛋白的亚细胞定位,使用SignalP 5.0进行信号肽分析,使用Psipred在线工具预测蛋白质的二级结构,使用clustalx进行多序列比对后利用ESPript在线软件(https:∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)对序列比对结果进行验证,同时将二级结构预测结果进行标注。基于星豹蛛PaGSTd1和PaGSTd2与其他物种GSTs氨基酸序列使用MEGA6软件采用邻接法(neighbour-joining method, NJ)构建系统发育树,各分支均进行1 000次的重复检验。

1.5 星豹蛛GST基因的时空表达检测

收集星豹蛛2龄若蛛60头、3龄若蛛35头、4龄若蛛20头、5龄若蛛10头、6龄若蛛4头和雌雄成蛛各1头,液氮速冻放入-80 ℃冰箱备用。选取星豹蛛雌雄成蛛各20头,液氮速冻后迅速在冰上解剖出头胸部、腹和足,样品放入液氮中保存备用。以上每个样品均进行3次重复。分别提取以上样品的RNA,并反转录合成为单链cDNA于-80 ℃保存备用。以β-Actin作为内参基因(李锐等, 2015)检测1.3节克隆的两个基因的时空表达。RT-qPCR扩增引物使用Primer Premier 5.0软件设计,上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。RT-qPCR扩增根据ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书进行。RT-qPCR反应体系(20 μL): 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA 1 μL, ddH2O 8.2 μL。RT-qPCR反应程序: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 40个循环;生成熔解曲线:95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。技术重复 3次。

1.6 溴氰菊酯胁迫后星豹蛛GST基因的表达量检测

选取体型均一且发育正常的星豹蛛雄成蛛,采用药膜法处理星豹蛛,检测1.3节克隆的2个GST基因在溴氰菊酯胁迫下的相对表达量。溴氰菊酯浓度参照本课题组已有的生物测定结果:LC10: 5.151 mg/L; LC30:8.619 mg/L; LC50:12.311 mg/L(李萨丽, 2017)。将溴氰菊酯用丙酮稀释为以上3个浓度作为试验组,对照组试虫使用等量的丙酮处理。药液放入4 mL离心管密封保存,用移液枪移取1 mL药液到指形管中,用手堵住管口晃动,使药液在管内壁形成一层均匀的药膜,阴凉处自然风干备用。向准备好的药管中转移星豹蛛雄成蛛,使雄成蛛在管内活动25 min后转移至另一个干净的指形管,放入人工气候箱中,开始计时。在6, 12, 18, 24和48 h时收集活跃的雄成蛛进行GST基因表达量检测。每个样品取样3头,重复3次。其中LC10共处理55头,LC30共处理70头,LC50共处理100头,对照组共处理45头。RNA提取及cDNA第1链合成同1.3节;RT-qPCR反应体系与步骤同1.5节。

1.7 数据分析

基因表达量数据用2-ΔΔCt方法计算,利用SPSS 25.0软件分析差异显著性,雌雄成蛛间相同组织中基因表达量差异进行独立样本t检验,其他数据使用Duncan氏新复极差法。

2 结果

2.1 星豹蛛GST基因的克隆与序列

克隆获得星豹蛛2个Delta亚族 GST基因PaGSTd1(GenBank登录号: OR096398)和PaGSTd2(GenBank登录号: OR096399) (图1),cDNA全长分别为708和793 bp,均包含一个645 bp完整的开发阅读框,编码214个氨基酸残基,推测蛋白分子式分别为C1111H1710N272O323S10和C1101H1722N274O324S10,分子量分别为24.37和24.30 kD,等电点分别为 5.09和6.45。PaGSTd1不稳定系数为40.33,属不稳定蛋白;PaGSTd2不稳定系数为35.12,属于稳定蛋白。PaGSTd1和PaGSTd2总平均亲水系数分别为-0.330和-0.368,预测两蛋白均为亲水性蛋白。PaGSTd1和PaGSTd2属于细胞质型GSTs,均没有信号肽,属于非分泌蛋白,二级结构与其他GSTs一样,含有完整的N端(第3-76位氨基酸)和C端(第90-207位氨基酸)结构域,且N端由β-α-β-α-β-β-α共由7个结构基序组成,而C端由5～6个α螺旋组成,没有β折叠。其中PaGSTd1 N端具有GSH结合位点:S11-H52-C53-V54-E66-S67,C端具有疏水性底物结合位点:I103-Y107-K108-G111-E112-Y115-K120-S164-F167-F206;PaGSTd2的N端具有GSH结合位:C11-H52-T53-V54-E66-S67,C端具有疏水性底物结合位点:N103-S107-K108-S111-E112-N115-N163-A167-F206。

系统进化树显示(图2),星豹蛛与拟环纹豹蛛Pardosapseudoannulata的亲缘关系最近,其中PaGSTd1与拟环纹豹蛛GST(GenBank登录号: QGA31147.1)的氨基酸序列一致性为90.19%,PaGSTd2与拟环纹豹蛛GST(GenBank登录号: QGA31146.1)的氨基酸序列一致性为96.73%。

图2 邻接法构建的基于氨基酸序列的星豹蛛与其他物种GSTs的系统进化树(1 000次重复)Fig. 2 Phylogenetic tree of GSTs of Pardosa astrigera and other species based on the amino acid sequence by neighbour-joining method (1 000 replicates)

2.2 星豹蛛GST基因的时空表达

不同发育阶段GST基因的相对表达量检测结果表明,PaGSTd1和PaGSTd2在星豹蛛各发育阶段均有表达。PaGSTd1在4龄若蛛中表达量最高,与6龄若蛛中的表达量无显著差异(P>0.05),其次是在成蛛、3龄若蛛和2龄若蛛中的表达量,在5龄若蛛中的表达量最低,显著低于其他发育阶段个体中的(P<0.05)(图3: A)。PaGSTd2在成蛛中的表达量最高,与在3龄若蛛中的表达量无显著差异(P>0.05),在5龄若蛛中的表达量最低,与在2, 4和6龄若蛛中的表达量无显著差异(P>0.05)(图3: B)。

不同成蛛组织中GST基因的相对表达量检测结果表明,PaGSTd1和PaGSTd2在星豹蛛雌雄成蛛头胸部、腹和足中均有表达,且存在显著性差异。PaGSTd1在雄成蛛足中表达量最高,显著高于在雄成蛛腹中的表达量(P<0.05),与在头胸部的表达量无显著差异(P>0.05);PaGSTd1在雄成蛛头胸部和足中的表达量显著高于雌成蛛的(P<0.05),在腹中的表达量于雌雄成蛛间无显著差异(P>0.05)(图4: A)。PaGSTd2在雄成蛛足中的表达量最高,在腹中的次之,在头胸部的最低;对于同种组织而言,PaGSTd2在雄成蛛的表达量均显著高于在雌成蛛的(P<0.05)(图4: B)。

图4 星豹蛛PaGSTd1(A)和PaGSTd2(B)在雌雄成蛛不同组织中的相对表达量Fig. 4 Relative expression levels of PaGSTd1 (A) and PaGSTd2 (B) in different tissues of female and male adults of Pardosa astrigera图中数据为平均值±标准差;柱上不同大小写字母分别表示雌雄成蛛不同组织间基因表达量经Duncan氏新复极差法检验差异显著(P<0.05);柱上符号表示同一组织不同性别之间基因表达量经独立样本t检验时的差异显著性(*P<0.05; ns P>0.05)。Data in the figure are mean±SD. Different uppercase and lowercase above bars indicate significant difference in the gene expression level among different tissues of female and male adults, respectively, by Duncan’s new multiple range test (P<0.05). Symbols above bars indicate significance of difference in the gene expression level in the same tissue between different genders by independent samples t-test (*P<0.05; ns P>0.05).

2.3 溴氰菊酯胁迫后星豹蛛GST基因的表达量

经LC10浓度溴氰菊酯胁迫18和24 h时PaGSTd1表达量与其他胁迫时间的表达量存在显著差异(P<0.05),且在24 h时表达量达到最高。LC30浓度溴氰菊酯胁迫6, 12, 18, 24和48 h时PaGSTd1表达量之间均存在显著差异(P<0.05),且在48 h时表达量最高,其次是18 h时的,在6 h时的表达量最低。LC50浓度溴氰菊酯胁迫6, 12和48 h时PaGSTd1表达量与其他2个时间点存在显著差异(P<0.05),在18 h时表达量最低(图5: A)。

LC10, LC30和LC50浓度溴氰菊酯胁迫6 h时,PaGSTd1表达量与对照组(等量丙酮处理)相比均显著降低(P<0.05),且LC30浓度下表达量最低;胁迫12 h时3个浓度间PaGSTd1表达量均没有显著差异(P>0.05);胁迫18 h时LC10和LC50浓度下PaGSTd1表达量与对照组相比显著降低(P<0.05),LC30浓度下PaGSTd1表达量与对照组相比显著上调(P<0.05);LC10, LC30和LC50浓度溴氰菊酯胁迫24 h时PaGSTd1表达量与对照组相比均显著上调(P<0.05),且LC10浓度下表达量最高,但LC30和LC50浓度下PaGSTd1表达量间无显著差异(P>0.05)。LC10和LC50浓度溴氰菊酯胁迫48 h时PaGSTd1表达量与对照组相比显著降低(P<0.05),LC30浓度下PaGSTd1表达量与对照组相比显著上调(P<0.05)(图5: A)。

LC10浓度溴氰菊酯胁迫6, 12, 18, 24和48 h时PaGSTd2表达量两两时间点之间均存在显著差异(P<0.05),且在6 h时表达量达到最高,24 h时表达量最低。LC30浓度溴氰菊酯胁迫12, 18和24 h时PaGSTd2表达量与6和48 h时的表达量存在显著差异(P<0.05),且在18 h时表达量最高,在24 h时表达量最低。LC50胁迫6 h时PaGSTd2表达量与12, 18, 24和48 h时表达量间存在显著差异(P<0.05),且在6 h时表达量最低(图5: B)。

溴氰菊酯胁迫6 h时,LC10浓度下PaGSTd2表达量与对照组相比显著上调(P<0.05),LC30和LC50浓度下PaGSTd2表达量与对照组相比显著降低(P<0.05),且LC50浓度下PaGSTd2表达量最低。胁迫12 h时,LC10和LC30浓度下PaGSTd2表达量与对照组相比均显著降低(P<0.05),且LC30浓度下PaGSTd2表达量最低。溴氰菊酯胁迫18 h时,LC10和LC30浓度下PaGSTd2表达量与对照组相比显著上调(P<0.05),且LC30浓度下PaGSTd2表达量最高,LC50浓度下PaGSTd2表达量与对照组相比显著降低(P<0.05)。溴氰菊酯胁迫24 h时,LC10和LC30浓度下PaGSTd2表达量与对照组相比显著降低(P<0.05),LC30浓度下PaGSTd2表达量最低,LC50浓度下PaGSTd2表达量溴氰菊酯胁迫显著上调(P<0.05)。溴氰菊酯胁迫48 h时,LC10, LC30和LC50下PaGSTd2表达量与对照组相比均显著降低(P<0.05),且LC30浓度下PaGSTd2表达量最低(图5: B)。

3 讨论

本研究基于星豹蛛转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆得到2个谷胱甘肽S-转移酶Delta亚族基因的cDNA全长序列。2个蛋白均包含完整的N端和C端结构域(图1),且N端包含有GSH结合位点(G位点)以及C端包含有疏水性底物结合位点(H位点),这两个位点构成了GST的活性中心。推测蛋白通过催化GSH与底物特异性结合,来减少虫体免受底物的损伤。多序列连配和系统进化结果显示,PaGSTd1和PaGSTd2的氨基酸序列与其他物种Delta亚族GSTs表现出很高的一致性,与拟环纹豹蛛的亲缘关系最近(图2)。Delta和Epsilon亚族是昆虫特有的家族(Kettermanetal., 2011)。已有研究多次报道GSTs通过基因上调表达对多种杀虫剂的胁迫做出了响应,说明与昆虫的抗药性紧密相关(Lietal., 2007)。

昆虫GST基因在不同组织中的表达存在一定的差异,而不同表达模式暗示其潜在的生物学功能(Wangetal., 2019)。一般认为,中肠、脂肪体和马氏管是昆虫三大主要的解毒器官(Mengetal., 2019)。在本研究中,PaGSTd1和PaGSTd2在星豹蛛成蛛头胸部、腹部和足中均有表达,且都是在足中表达量最高(图4)。蜘蛛的头胸部是神经中枢的聚集地(龚忱和王智, 2011),且分布有口、咽、食道和吸吮胃,这些消化器官主要作用是把食物吸入体内;蜘蛛腹部分布有中肠和马氏管,足部分布着中肠分支盲囊,主要作用是暂时储存液态食物(张征田等, 2010)。可以推测出GST基因在星豹蛛成蛛不同组织中均发挥着解毒代谢的作用,而足部盲囊对食物的储存可能提高了足部GST基因的表达来代谢外源有毒物质。

昆虫GST基因生长发育的表达在不同物种间具有特异性(Liuetal., 2017)。杨雪清(2014)的研究表明,苹果蠹蛾CpGSTd1在幼虫阶段表达量较低,在蛹和成虫期表达量较高;而You等(2015)的研究表明小菜蛾的GSTd4和GSTd5在幼虫阶段的表达量要显著高于其他阶段的,与本研究2个基因在星豹蛛不同发育阶段的表达模式不同。在本研究中,PaGSTd1和PaGSTd2在星豹蛛6个发育阶段均有表达,说明GST基因参与了星豹蛛整个生长发育过程。PaGSTd1在4龄若蛛、6龄若蛛和成蛛表达量较高,PaGSTd2在3龄若蛛和成蛛中表达量高(图3)。在若蛛期表达量高可能是由于若蛛在生长发育的过程需要提高代谢来抵御外来有毒物质的入侵;成蛛表达量高可能是由于成蛛捕食量过大,通过基因的高表达来达到解毒代谢的目的。也可以推测出星豹蛛不同GST基因在其生长发育的不同关键时间点起作用。

溴氰菊酯,又叫敌杀死,是拟除虫菊酯类农药中杀虫活性较大的一种,具有触杀和胃毒作用,且触杀作用迅速,击倒力强。已有大量研究表明,昆虫抗药性的产生与基因过表达有关。樊东和刘艳(2019)用不同浓度高效氯氰菊酯处理黏虫不同时间,结果显示,在处理24 h时,各浓度处理MsGSTe1表达量显著上调,且谷胱甘肽S-转移酶的酶活性提高,这与本研究中不同浓度溴氰菊酯处理星豹蛛24 h后PaGSTd1表达情况一致。金燕璐等(2018)用氯虫苯甲酰胺胁迫二化螟Chilosuppressalis12 h后,10个基因表达量显著上调,推测这些基因对氯虫苯甲酰胺的胁迫做出了响应;而在本研究中,溴氰菊酯胁迫星豹蛛12 h后2个基因表达量均低于对照,但在其他时间点出现了表达量升高的情况。推测可能因为药剂处理后星豹蛛虫体出现中毒现象,基因选择性下调表达,起一个补偿作用。PaGSTd1在LC30浓度溴氰菊酯处理18和48 h后被显著诱导,LC10浓度溴氰菊酯处理下在24 h时被显著诱导后又恢复到之前表达水平(图5: A)。PaGSTd2在LC10浓度溴氰菊酯处理下基因表达处于一个反复波动的情况,具体原因需要进一步探究;在18 h时LC10和LC30浓度溴氰菊酯处理PaGSTd2都被诱导表达,LC50浓度溴氰菊酯处理在24 h时PaGSTd2被诱导表达(图5: B)。由此可以推断溴氰菊酯对PaGSTd2的诱导存在明显的浓度和时间效应,且不同时间虫体对药物的敏感程度不一。进一步可以证明,有基因上调的同时必然有基因下调去参与解毒,每个解毒酶基因在不同的药剂处理时间发挥不同作用,才能维持虫体的正常生理需求。本研究可以初步推测出星豹蛛PaGSTd1和PaGSTd2两个基因对溴氰菊酯的胁迫做出了一定程度的响应。

本研究成功克隆得到2个星豹蛛谷胱甘肽S-转移酶基因,并分析其时空表达模式以及溴氰菊酯胁迫后基因的表达情况,初步推测出两基因对溴氰菊酯的胁迫做出了响应,为后续继续通过RNAi或基因敲除等技术探究基因的功能提供线索。