肌内结缔组织热特性及其影响因素研究进展

刘思嘉，柴笑玉，程书梅，时子丹，田寒雪，张志胜，饶伟丽*，王媛

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定 071001；2.衡水志豪畜牧科技有限公司，国家羊肉加工技术研发专业中心，河北衡水 053000）

改善肉制品的感官属性以满足消费者对优质肉质的需求，是肉类科学和技术领域面临的一个持久挑战。结缔组织（intramuscular connective tissue，IMCT）是肌肉的重要组成部分，是影响肉品品质变化的重要因素之一。在过去的几十年，嫩度是消费者对牛肉等肉品感官品质总体可接受度最重要的贡献指标，所以大多数研究更加关注IMCT 对肉品嫩度变化的影响[1-2]。但有研究表明，牛肉整体接受度最重要的贡献者已经由嫩度转变为风味（39%），其次是嫩度（31%）和多汁性（24%）[3]。对于感官品质得分较高的牛排来说，每一个感官指标都会有较高的分数，对总体接受度的贡献也更高。因此，本文除关注IMCT 和肉品嫩度的关系外，也关注IMCT 与感官品质其他指标的关系，如与多汁性、风味的关系，并总结IMCT 影响肉品多汁性、质构与风味的可能原因。

TMCT 的主要成分是胶原蛋白，其余包括弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等成分，但后者含量较少。本文聚焦于胶原蛋白，总结加热工艺、动物年龄、动物种类等对胶原蛋白收缩、热熔和交联等热特性的影响；分析蛋白聚糖降解和胶原蛋白热特性的关系；分析原料肉宰后成熟过程中IMCT 相关内源性降解体系和胶原蛋白热特性的关系，以期能够发现可以调控肉品中内源酶活性和胶原蛋白热特性，改善IMCT 收缩和溶解等热特性的路径，为提高肉品的感官品质指明研究方向。

1 结缔组织热特性及其对肉品感官品质的影响

IMCT 由肌内膜、肌束膜和肌外膜3 个主要的组件构成，其在加热时的特性变化对肌肉加工过程中的品质变化有重大贡献[4]。除了对肉的嫩度有直接贡献[5-6]，IMCT 还通过其在烹饪过程中的收缩作用挤出加热时肌原纤维中释放出的液体，间接影响肉品的多汁性、风味和质构[7]。下文总结了在不同温度区间加热时，IMCT影响肉品品质的机制，其中存在的差异可能与文献中动物种类、肌肉部位、加热工艺等因素有关，需要更多的研究来阐明IMCT 在加热时的热特性变化规律。

在加热过程中，当温度达到35～45 ℃时，肌纤维中肌球蛋白发生变性，导致肌肉发生垂直于肌纤维方向的横向收缩[8]，使肌原纤维中水分向胞浆迁移，单位面积中肌纤维的数量增加，肉品嫩度变差。肉中的脂肪也会在此温度下发生溶解，此时由于自由水和液态脂肪的增加，肉品中汁液开始向肉品外流动。

温度达到40～55 ℃时，肌束膜拉伸断裂强度大幅度增加。Christensen 等[7]认为这是由于部分胶原蛋白在50 ℃左右发生变性，弯曲的胶原蛋白变直，导致单位宽度胶原纤维的有效浓度增加，从而使其承载力增加。Wang 等[9]通过原位成像技术，发现在此温度下仅有肌束膜中胶原蛋白发生了变性，而肌内膜中的胶原蛋白并未发生变性，这可能是由于肌束膜与肌内膜中胶原蛋白的类型不同。在此温度区间，肉品剪切力值增加，但从55 ℃左右开始下降。并且肌原纤维中水分继续向外迁移，脂肪细胞中脂肪继续融化，肉品的汁液流失程度增加。

温度达到55～64 ℃时，肌肉开始平行于肌纤维方向的纵向收缩，这极有可能是IMCT 收缩造成的。研究表明，在50 ℃结缔组织开始发生纵向收缩[10]，而分离的肌原纤维碎片在75 ℃左右才开始发生纵向收缩[8，11]。但通过使用扫描电镜对肌束膜进行观察发现，当处理温度为60 ℃，加热时间在60 min 以内时，肌束膜结构仍然规则清晰、连接紧密，没有发生显著的变化。胶原蛋白是肌束膜的主要组成成分，其变化会导致肌束膜的特性变化，而胶原蛋白的变性温度在65 ℃左右，当胶原蛋白的加热温度高于变性所需温度时，氢键遭到破坏，其理化和生物学特性随之发生变化[12-13]。胶原蛋白在60 ℃时并未或只有少部分发生了变性，所以在此时肌束膜没有发生显著变化。但是Purslow[14]发现低温（60 ℃）长时（90 min）加热也会使胶原蛋白发生变性，即这种方式也会导致氢键的断裂，使胶原纤维结构变得松弛并开始进行收缩，从而引发肌束膜的收缩。结缔组织的收缩同时也会造成肌内脂肪细胞的收缩，导致脂肪从肉品中大量流出，从而影响到肉品的多汁性，风味也会受到一定影响。这对于大理石花纹等级较低的肉品，影响可能更大，但目前尚未发现相关的研究来证实。

温度达到65 ℃及以上，胶原蛋白发生剧烈变性，胶原纤维的收缩会导致结缔组织发生强制性的收缩，这种收缩最终会导致肌肉体积的缩小，从而增加肌肉的韧性[15]。Wang 等[9]的研究表明，在50～70 ℃时，肌肉的剪切力下降，这很可能是由此时肌束膜的拉伸断裂强度逐渐降低导致的[10]，因为胶原蛋白的热溶解性和可溶性胶原蛋白含量均会随着温度的升高与加热时间的延长而升高[16]，从而影响到结缔组织的强度。此时肉品嫩度得到改善，多汁性进一步下降。

加热温度在70～80 ℃时，肌束膜中胶原蛋白的共价化学键遭到破坏，呈现出规则的颗粒状结构[9]。结缔组织收缩和碎裂明显增加，胶原纤维溶解度提高，出现凝胶化现象，肌内膜收缩加剧，直径和长度收缩到原来的70%和40%[17]。肌束膜中胶原纤维的降解在70 ℃时开始，在80 ℃时观察到强烈的崩解，而整个肉块和肌纤维的收缩比例小于30%。大多数肌肉的最大横向收缩率约为10%～11%，因此加热导致的肌内膜的收缩程度大于肌纤维的收缩程度，造成肌纤维之间空隙减小、肉中汁液流失、单位面积的肉品内肌纤维密度增大、肉质变硬。

加热温度达到80 ℃及以上时，肌束膜和肌内膜结构几乎完全被破坏[9]，未被耐热分子间键稳定的胶原纤维会溶解并形成明胶，表现出凝胶化现象，肌肉嫩度得到改善。

2 加热过程中胶原蛋白热特性影响因素

胶原蛋白是结缔组织的主要结构成分，由长约280 nm、直径1.4～1.5 nm 的原胶原蛋白单体组成，分子量为300 000 Da。原胶原分子在肌外膜和肌束膜周围聚集形成延伸的纤维，或作为肌内膜主要的结构基质。加热时可溶性胶原的溶解，不溶性胶原的热变性和收缩等热特性会对肉品的嫩度等感官品质产生影响[18]，影响加热过程中胶原热特性的因素如下。

2.1 胶原蛋白类型对胶原蛋白热特性的影响

不同肌肉部位甚至同一块肌肉中都会含有不同类型的胶原蛋白，其变性温度、收缩温度、热降解等性质会有差别，如I 型胶原比III 型胶原更容易被加热降解[19]。Bruggemann 等[20]发现猪肉内有些胶原蛋白会在57～59.5 ℃变性；有些胶原蛋白在59～61 ℃的温度下发生变性，三螺旋结构展开；另一部分胶原蛋白在高达68 ℃的温度下仍保持稳定的结构。在加热时发生溶解的胶原蛋白还会随着加热温度的升高形成明胶，但热溶性胶原的比例不固定，通常只占结缔组织中总胶原的一小部分，大部分胶原蛋白仍然是不溶的[21]。这些烹饪后剩余的热不溶性胶原蛋白会对最终熟肉的品质产生影响，所以未来研究的重点在于研究热不溶性胶原蛋白成分及性质，以及如何降解和转化热不溶性胶原蛋白。

不同种类的动物体内的胶原蛋白组成不同，这也会导致其最终展现出的变性温度不同。如哺乳动物中的胶原蛋白在65 ℃时发生变性；鸡肉中的胶原蛋白在65.3 ℃时发生变性；牛肉中胶原蛋白在69.2 ℃发生变性；鲈鱼中胶原蛋白在27.2 ℃就发生变性。因此消费者在烹饪过程中可根据不同肉类及其不同部位的胶原变性温度选择适合的烹饪方法。

2.2 加热工艺对胶原蛋白热特性的影响

不同的加热处理会对胶原蛋白热特性产生显著的影响。研究者通过扫描电子显微镜观察，发现加热过程中胶原蛋白会发生变性，并且随着加热时间的延长，变性胶原的比例会缓慢增加[22-23]。王静帆等[24]在对猪肉胶原蛋白含量的测定中也发现，热溶性胶原蛋白含量随着加热时间延长与温度的升高而增加。何龙等[25]和孔令明[26]分别测量了牛蹄皮和马肉中胶原蛋白的含量，也得到了相同的结论。并且Chang 等[27]发现在加热温度达到65 ℃及以上时，这个趋势会更明显，所以60 ℃和65 ℃的加热温度对于改变胶原蛋白的特性是关键的。

但有研究发现，如果将肉类缓慢加热，相当数量的胶原蛋白会在较低的温度下发生变性。Purslow 等[28]解释了出现这一现象的原因，即在大多数文献中使用快速升温速率（5～10 ℃/min）的差示扫描量热法得出胶原的热变性温度在62～67 ℃，但该过程高度依赖于升温速率，因为基于Lumry-Eyring 模型的胶原蛋白展开和变性的非平衡、多步骤过程的差示扫描量热法的数据分析高度依赖于加热速率，在55～60 ℃的缓慢加热状态下测定的胶原蛋白变性温度可能会下降。何龙等[25]的研究结果也表明，加热温度和时间均会使牛蹄皮组织结构受到影响，并且在加热时长超过50 min 后，不同温度处理的牛蹄皮均显示出较低的剪切力值。王浩明等[29]通过测量猪耳在卤制过程中剪切力的变化，发现蒸煮温度在85 ℃以下时，剪切力在蒸煮90 min 时达到最大，而温度高于90 ℃时，在80 min 时剪切力达到最大，说明长时间低温加热可以使肉的嫩度改善。

2.3 动物年龄对胶原蛋白热特性的影响

动物在不同成熟阶段也会使胶原蛋白表现出不同的热特性。Panea 等[30]在品种对欧洲肉牛胶原蛋白影响的研究中发现，动物的屠宰年龄会对肉品中胶原的溶解度产生影响，屠宰年龄较低的牛肉会有更低的胶原蛋白溶解度。这是由于在动物成熟过程中可还原的交联会逐渐转变为更稳定、不可还原的交联，导致溶解性降低。

在成熟度低的动物中，热不稳定性的交联存在于肌外膜和肌束膜中，而热稳定性的交联存在于肌束膜和肌内膜中，交联的存在会增大肌肉的韧性[12]。并且随着动物年龄的增长，热不稳定性的交联会向热稳定性交联转变，也就是热稳定交联比例会有所升高，这就导致结缔组织在烹饪过程中会产生更大的张力[31]。同时热稳定性交联的比例也影响了胶原蛋白的热变性温度，肌内膜胶原蛋白的热变性温度升高，而肌束膜内胶原呈现下降趋势[32]。

现有的研究大多探究了热稳定性胶原蛋白在动物生长过程中的交联现象，通过降低屠宰时的动物年龄和/或用生长促进剂诱导肌肉重建，可以降低肌肉中热稳定交联的含量[33]。然而，在加热过程中，关于热稳定性胶原蛋白的交联情况的研究较少，探究如何改善这种交联情况或许可以为提高肉嫩度提供一个思路。

2.4 蛋白聚糖降解对胶原蛋白热特性的影响

蛋白聚糖（proteoglycans，PGs）在肌束膜与肌内膜中以65 nm 的间隔与胶原纤维相缔合，连接并稳定着胶原纤维，维持着肌内膜和肌束膜的结构[34]。宰后成熟过程中，胶原蛋白网络分解成胶原纤维，而PGs 的降解会导致胶原纤维暴露在胶原酶之下并促进其降解[35]。

Veiseth-Kent 等[36]通过免疫组织化方法，发现在宰后成熟2～13 d 内，背最长肌和冈下肌中的蛋白聚糖均有不同程度的降解，同时肌内膜胶原蛋白解螺旋需要的能量变少，推测蛋白聚糖的降解有利于加热时胶原蛋白的解螺旋。Nishiumi 等[37]也发现，软骨素酶水解掉蛋白多糖上的糖胺聚糖后，胶原蛋白在加热时更容易发生溶解，推测是因为糖胺聚糖拥有固定胶原纤维的能力，糖胺聚糖水解后，胶原纤维网络结构弱化。但是该研究并没有测定软骨素酶处理后肌内膜热收缩相关数据，无法判断糖胺聚糖水解是否和肌内膜收缩有关。但也有学者认为，横向堆积的分子间的离子相互作用导致了纤维状胶原蛋白热稳定性的变化，而共价交联与蛋白聚糖相互作用的影响不大[18，38]。

3 原料肉结缔组织内源降解体系及其和结缔组织热特性的关系

3.1 基质金属蛋白酶降解结缔组织情况

结缔组织可被多种酶降解，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是其中很重要的一类。MMPs 可以水解包括结缔组织在内的细胞外基质中除多糖以外所有物质，并且它是目前为止发现的唯一可以水解结缔组织中纤维素类胶原的蛋白酶类。MMP-2和MMP-9 是研究最多的基质金属蛋白酶，其可以降解明胶，水解层粘连蛋白、间质胶原等结缔蛋白，并且其降解底物还在不断被发现和更新。但目前MMP-2 和MMP-9 对肌肉结缔组织的全部降解底物尚不明确。

CHA 等[39]的研究结果表明肌肉中MMP-2 和MMP-9可以被激活数倍，并且在直径较小的肌纤维周围具有更强的酶活性。MMPs 在肌肉中的表达和活性受到严格的调控，而纤溶酶或许是MMPs 强有力的生理性激活物。研究者在组织型纤溶酶原激活物敲除的小鼠体内发现MMP-2 和MMP-9 活性的下降，细胞外基质的合成和含量增加[40]。同时纤溶解酶在肌肉的肌束膜和肌内膜相应位置的表达，说明MMPs 的活性极有可能是由纤溶酶激活，从而实现细胞外基质的降解和重塑。但是目前还未发现直接证据证明纤溶酶在调控肌肉中细胞外基质，特别是肌束膜和肌内膜降解和重塑中的作用。除了通过激活MMPs 的活性来增加结缔组织的降解外，纤溶酶还可能直接对结缔组织进行降解，并有可能在降解结缔组织的某些成分后，使结缔组织更容易被MMPs 降解，从而使嫩度得到改善。

在肉品科学领域，宰后成熟过程中MMPs 的活性调控及其和肉品品质的关系研究还很缺乏。刘纪璇[41]在冰鲜草鱼片由内源蛋白酶介导的结缔组织降解模式研究中发现，结缔组织的降解和内源性基质金属蛋白酶家族，尤其是胶原酶MMP-2 和MMP-9 有关。同时Rao 等[42]的研究结果表明，随着贮藏时间的延长，羊肉中MMPs 的活性浓度在逐渐增加，贮藏7 d 后，活性浓度显著高于贮藏1 d 的浓度。同时发现MMP-2 和MMP-9 的降解底物β 型肌聚糖（β-dystroglycan，β-DG）在宰后发生了显著降解，这说明宰后MMPs 可能参与了细胞外基质的降解，但还需要进一步证实。未来或可通过MMPs 来调控结缔组织的降解，调节肉品收缩情况，从而改善肉品质。

3.2 内源降解系统对蛋白聚糖的降解及其和胶原热降解关系

PGs 会在宰后贮藏过程中降解，分子量约3 000 kDa的PGs 在贮藏7 d 内下降至原始值的40%，在宰后4 d检测到了分子量约为20 kDa 的条带，可能是高分子量PGs 的降解产物[35]。Nishimura 等[35]的试验发现，在贮藏28 d 后，基底膜内的PGs 消失，肌周膜内PGs 大部分消失，总PGs 含量随宰后时间的延长而降低，表明PGs在牛肉宰后贮藏过程中会发生降解。总PGs 含量随着宰后时间的延长而减少，表明PGs 在牛肉的宰后贮藏过程里会发生降解。

研究者认为PGs 降解的机制有两种可能性，一种是PGs 的自发降解，另一种是酶促降解[35，43]。目前大部分研究集中在酶促降解，即酶导致的PGs 降解，但大多是关于动物生长过程中结缔组织中PGs 的变化情况，而在肉品贮藏中PGs 变化的研究较少。蛋白聚糖降解体系包括β-葡萄糖醛酸酶、透明质酸酶和硫酸软骨素酶等。在肉品科学领域，关于这些酶在宰后成熟过程中对肌束膜和肌内膜成分的降解及热特性的影响的研究较少。

β-葡萄糖醛酸酶是溶酶体内的酸性水解酶，是蛋白聚糖降解的酶原之一，直接参与蛋白聚糖和细胞外基质的降解过程。有研究表明β-葡萄糖苷酸酶的活性随着牛肉嫩度的增加而增加[35]，这可能是由β-葡萄糖苷酸酶攻击了肉里的PGs，导致结缔组织松散造成的。

透明质酸酶是指能够将透明质酸及部分糖胺聚糖降解成二糖或小分子寡糖的一类糖苷酶，其最适反应温度在20～50 ℃，大都属于中低温酶，普遍在高于55 ℃时便会失活[44]。它的来源有很多，包括微生物发酵、动物组织提取或者基因重组等。Souza 等[45]使用透明质酸酶处理妊娠白鼠细胞外基质，检测到糖胺聚糖浓度显著降低，同时也检测到PGs 的表达降低。

软骨素酶可以降解硫酸软骨素蛋白聚糖，其作用原理是破坏两个二糖重复单元之间的β-糖苷键。Nishiumi 等[37]使用软骨素酶处理结缔组织，观察到肌内糖胺聚糖对溶酶体酶的蛋白水解攻击胶原表现出保护作用，并随着糖胺聚糖的拆分，胶原的热稳定性降低。这表明软骨素酶降解掉了蛋白聚糖上的糖胺聚糖，即硫酸软骨素，从而导致胶原解体，降低结缔组织稳定性。

4 总结

结缔组织的热收缩和热溶解特性会对肉的品质产生影响，但目前对结缔组织与肉品多汁性、风味和质构等品质指标的关系研究尚不全面。肉品加热工艺流程、动物年龄、蛋白聚糖降解等都可以影响结缔组织的主要成分胶原蛋白的热特性，从而使肉品表现出不同的感官品质。在今后的研究中，可以关注MMPs、β-葡糖醛酸酶等内源酶与结缔组织成分降解的关系，以及其与结缔组织热特性的关系，以期通过调控这些酶的活性来改善肉品的感官品质。