无舌川西小黄菊的抗炎及促凝和抗凝活性的初步测试

赵双双 尹子丽 李 翔 杨丽萍

云南中医药大学，云南 昆明 650500

无舌川西小黄菊(Pyrethrumtatsienensevar.tanacetopsis)系菊科(Compositae)匹菊属(Pyrethrum)植物川西小黄菊(Pyrethrumtatsienense)的变种。多年生草本，生长于海拔3500～5200 m 的灌丛、高山草甸或山坡砾石地等。在我国主要分布于云南的贡山、德钦、丽江及西藏等地[1-2]。贡山怒族人民多称其为“雪参”。该植物在怒族人民的日常生活中有较为广泛的运用，并深受欢迎。怒族人民多用于高血压、风湿类疾病、胸背痛、头痛、湿热、刀伤或跌打损伤的治疗[2]，还因其特殊的香味，也常被作为香料使用，多用作煮鸡、炖肉等烹饪调料。但其药用功效和用法是在民间实践的经验中积累出来的，对其化学成分和现代药理学研究尚未见报道。

此外，其原种川西小黄菊是一味藏药，藏名译音“色尔君木多美”，以全草入药，性寒、味苦。有活血、祛湿、消炎止痛功效，主治跌打损伤，湿热[1]。对该种植物的化学成分研究表明其主要包含单萜、倍半萜、三萜、黄酮、香豆酸和聚炔类化合物[3-7]，而黄酮是其主要成分[5-7]。药理学研究[8]表明川西小黄菊的水提、醇提物具有镇痛抗炎、抗缺氧及肝损伤保护活性。一氧化氮(nitric oxide，NO)具有广泛而重要的生物学调控功能，在炎症、肿瘤及心血管系统等均有重要作用。当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶(induced NO synthase，iNOS)，产生NO进行免疫应答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标[9-10]。此外，正常血液循环中，血小板处于静止状态，在受伤或其他病理条件下，血小板发生活化、聚集。止血及活血都与血小板的活性有关[11]。笔者通过选取无舌川西小黄菊的抗炎及促/抗凝血活性的药理模型进行初步测试，并对无舌川西小黄菊中总黄酮含量及抗氧化活性进行测定，还通过气相色谱-质谱联用技术分析其精油化学成分，旨在为其药理作用研究及其入药提供试验依据。并阐明变种无舌川西小黄菊和川西小黄菊是否具有类似的药理活性，从而为川西小黄菊提供替代来源奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 研究对象 无舌川西小黄菊，样本采自贡山县嘎娃嘎普雪山。经中国科学院武汉植物园胡光万研究员鉴定为菊科匹菊属植物无舌川西小黄菊。

1.1.2 动物 日本大耳白兔，许可证号：SYXK(湘)2019-0004，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。由昆明植物研究所天然药物活性筛选中心提供。实验动物自由摄食饮水，实验前适应性饲养7 d。

1.1.3 细胞 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中科院上海细胞库。

1.1.4 试剂 DMEM培养基和胎牛血清购自BI公司。Griess Reagent、LPS、对照药物L-NMMA、肝素(HEP，批号119K1581)购自Sigma公司。乙醇消毒液(批号：181206，云南利键消毒制品有限公司)；ADP (批号：3449，美国Chronolog公司)；DMSO(批号：RNBB7886，sigma公司)。凝血质控血浆(批号：093B-J186A，德国TECO公司)；PT试液(批号：10002706，德国TECO公司)；Tris-HCl(批号：20160118，美国Amresco公司)；TT试液(批号：30002697，德国TECO公司)；APTT试液(批号：20002745，德国TECO公司)；CaCl2(批号：031N-J073A，德国TECO公司)；依诺肝素(LMWH，批号：4SH69，葛兰素史克)。亚硝酸钠(批号：20160705，天津市大茂化学试剂厂)；三氯化铝[批号：GA030192，萨恩化学技术(上海)有限公司]。无水硫酸钠(批号：20200407国药集团化学试剂有限公司)。氢氧化钠(批号：170703，四川西陇化工有限公司)。芦丁(批号：R189033，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；维C(批号：STBH7296，生工生物)

1.2 仪器 Chronolog-700型血小板聚集仪、一次性比色杯 (批号418503)、搅拌子(批号91415A)均为美国Chronolog公司产品；5804R型低速冷冻离心机，一次性4 mL枸橼酸钠抗凝真空采血管 (批号20200413，武汉致远医疗科技有限公司)；医用一次性采血针(批号20181229，江西洪达医疗器械集团有限公司)；VORTEX-5旋涡混匀器(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；METTLER TOLEDO XS105型电子天平(瑞士梅特勒-托利多)；移液枪(eppendorf research plus，德国艾本德)。德国美创MC-4000血凝仪、瑞士步琦旋转蒸发仪、赛默飞Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度计；TECAN帝肯Infinite M200 Pro多功能酶标仪。Agilent-6890 型气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪(美国 Agilent Technologies 有限公司)。cyclodex-b色谱柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，美国 Agilent Technologies 有限公司。

2 方法与结果

2.1 提取 取无舌川西小黄菊全草500 g，用95%甲醇室温浸泡提取3次(3天、2天、2天)，合并3次提取液，减压蒸馏浓缩后得粗提浸膏W1并记录其总重量。将浸膏分散于水中，分别用石油醚和乙酸乙酯进行萃取。萃取后分别减压蒸馏浓缩得到石油醚和乙酸乙酯萃取相浓缩物并记录它们的总重量。得到粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2待用。

取新鲜无舌川西小黄菊全草100 g，以水蒸汽蒸馏法提取，乙醚带馏，提取时间为8 h。馏出液经无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去乙醚，获得110 mg黄色挥发油。

2.2 无舌川西小黄菊提取物对一氧化氮(NO)生成抑制活性的检测 将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞接种至96孔板，用1 μg/mL LPS脂多糖诱导一氧化氮合成酶的生成，导致NO浓度显著增高。同时加入待测化合物(终浓度50 μg/mL)处理，设置不含药物组和L-NMMA(L-单甲基精氨酸，一氧化氮合成酶抑制剂)组做对照。细胞过夜培养后取培养基通过Griess法检测NO生成，在570 nm处测定吸光值来检测亚硝酸盐(NO2-)的相对含量，从而达到评价化合物在细胞水平抑制NO生成活性的目的。在剩余培养基中加入MTS，孵育2 h后进行细胞存活率检测，排除化合物对细胞的毒性影响，同时排除化合物对NO生成抑制活性是由细胞毒性过大而造成假阳性的可能。IC50值测定时，待测化合物浓度从50 μg/mL开始2倍稀释。

NO生成抑制率(%)=(非药物处理组OD570 nm-样品组OD570 nm)/非药物处理组OD570 nm × 100% IC50(50% concentration of inhibition)按Reed&Muench法计算。

无舌川西小黄菊提取物在50 μg/mL浓度下的一氧化氮(NO)生成抑制活性详见表1。其中W1在50 μg/mL浓度时有显著细胞毒性，结果仅供参考；其浓度降低至12.5 μg/mL时(已无明显毒性)的抑制率为43.42%±0.47%，与阳性对照L-NMMA在50 μM(12.4 μg/mL)的抑制率51.74%±0.62%接近。W2在50 μg/mL浓度时有非常显著的抑制活性。

表1 无舌川西小黄菊提取物NO生成抑制率

为了深入研究无舌川西小黄菊提取物的一氧化氮(NO)生成抑制活性，课题组测定了两种提取物对一氧化氮(NO)生成抑制活性的IC50值(表2)。其中W1在高浓度(50 μg/mL和25 μg/mL)时有细胞毒性，抑制率是不准确的。降低浓度后其抑制率未超过50%，因此无法得到IC50。W2的IC50值为(21.53±0.68)μg/mL，高于阳性对照L-NMMA的IC50值(46.82±0.22)μM[(11.62±0.05)μg/mL]。文献[12]报道紫茎泽兰具有抗炎活性，其甲醇提取物一氧化氮(NO)生成抑制活性的IC50值为50.38 μg/mL，高于W2的IC50值，说明无舌川西小黄菊提取物的抗炎活性要明显高于紫茎泽兰提取物的抗炎活性。文献[13]报道具有抗炎活性的二萜类化合物pepluanone的一氧化氮(NO)生成抑制活性的IC50值为31.40 μg/mL，也高于W2的IC50值，说明无舌川西小黄菊提取物的抗炎活性甚至要比某些单体化合物的抗炎活性还要好。综上所述，无舌川西小黄菊提取物显示了良好的一氧化氮(NO)生成抑制活性。

表2 无舌川西小黄菊提取物NO生成活性的IC50值

2.3 无舌川西小黄菊提取物的诱导血小板聚集活性 样品配制：精确称取W1和W2，加入DMSO配制成浓度40 mg/mL溶液，最后用P h 7.4 0.02 M Tris-HCl(含5% Tween 80)稀释至4 mg/mL。阳性对照二磷酸腺苷(ADP)试液，按说明书方法配制成浓度1 mmoL/L溶液，按100 μL/管分装后冷藏(-80 ℃)备用。

富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)的制备：日本大耳白兔耳中央用乙醇消毒液擦拭后，用医用一次性采血针经耳中央动脉抽取血液 (枸橼酸钠真空抗凝采血管，全血：枸橼酸钠为9∶1)，轻轻颠倒采血管数次使血液和抗凝剂混合均匀。所得抗凝血离心 (200 μg，10 min)，收集上清液为富血小板血浆 (PRP)；剩余血液再次离心 (2400 μg，20 min)，收集上清液为贫血小板血浆 (PPP)，以PPP调PRP血小板计数为500(109个/L)[14]。

血小板聚集实验：将带搅拌子的比色杯与不带搅拌子的比色杯分别置于血小板聚集仪预温孔，37 ℃预温10 min。向预温好的带搅拌子的比色杯中加入250 μL PRP，不带搅拌子的比色杯中加入250μL PPP，同时加入2.5 μL溶解样品所用的溶媒。然后继续预温5 min后，将两比色杯分别放入PRP测试位和PPP测试位。调整记录曲线的基线，按表2所示剂量向PRP测试杯中加入诱导剂或受试样品，记录血小板聚集曲线并计算最大聚集率。

表3 无舌川西小黄菊提取物诱导血小板聚集活性

样品W1、W2，在400 μg/mL 的终浓度下，均没有明显诱导兔血小板聚集的作用，诱导家兔血小板聚集的最大聚集率分别为8.8%±11.3%，6.2%±5.2%，与阴性对照DMSO比较没有显著性差异(P>0.05)；阳性对照ADP(10 μM)诱导家兔血小板聚集的最大聚集率为64.7%±5.5%，与阴性对照比较具有非常显著性差异(P<0.01)。

2.4 无舌川西小黄菊提取物的抗凝血活性PT、TT、APTT测试 样品配制：电子天平分别精确称取W1和W2，加入DMSO配制成浓度40 mg/mL溶液，最后用Ph 7.4 0.02M Tris-HCl(含5% Tween 80)稀释至4 mg/mL。阳性对照：PT，肝素(HEP)；TT和APTT，依诺肝素(LMWH)。 空白对照：pH7.4 0.02M Tris-HCl (含5% Tween 80和10% DMSO)作为空白对照。

试验检测：按试剂盒说明书进行，在37 ℃预温比色杯中加入待测样品溶液或对照品溶液，然后加入人质控血浆，37 ℃下预热2 min，分别加入PT、TT (37 ℃预温)试剂，记录凝血时间。加入 APTT试剂，37 ℃下孵育3 min后，加入0.02 M CaCl2(37 ℃预温)，记录凝血时间。

PT(prothrombin time)凝血酶原时间，是在待测血浆中加入过量的组织凝血活酶浸出液和钙离子，使凝血酶原转变为凝血酶，进而使得纤维蛋白原变为纤维蛋白，从而使得血浆凝固所需时间。TT(thrombin time)血浆凝血酶时间，是在待测血浆中加入标准化的凝血酶溶液，促进纤维蛋白原变为纤维蛋白，导致血浆凝固所需时间。APTT(activated partial thromboplastin time)活化部分凝血活酶时间，是在37℃下以激活剂激活因子Ⅻ和Ⅺ，以部分凝血活酶脑磷脂悬液代替血小板提供凝血的催化表面，在钙离子参与下，血浆凝固所需要的时间。它们分别代表了外源性凝血途径、共同凝血途径和内源性凝血途径，反映了化合物体外抗凝血活性。由表4可知，受试样品W2，对PT有微弱的延长作用，W1则没有效果。由表5可知，受试样品W1和W2，对TT均没有影响。由表6可知，受试样品W1在检测浓度下能微弱缩短APTT，而W2对APTT均没有影响。

表4 无舌川西小黄菊提取物抗凝血活性PT测试

表6 无舌川西小黄菊提取物抗凝血活性APTT测试

2.5 无舌川西小黄菊总黄酮含量测定 无舌川西小黄菊总黄酮的提取：精确称取无舌川西小黄菊粉末，用甲醇90 ℃回流提取制备总黄酮溶液，定容加入乙醇配制成一系列浓度梯度的溶液。

芦丁标准曲线的绘制：精确称取芦丁样品，用乙醇配置成标准溶液。分别取30 μL、50 μL、70 μL、90 μL、110 μL、130 μL的标准溶液，加入70%乙醇补至体积均为130 μL。加入40 μL 5%的NaNO2，混匀静置6 min，加入40 μL 8%的AlCl3，混匀静置6 min，加入 290 μL 5%的NaOH，混匀静置15 min。以不加芦丁标液的空白组作为对照在510 nm处测量各组的吸光度。以芦丁标准品溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线方程y=0.031x-0.0012(R2=0.9991)。如图1所示。

图1 芦丁标准曲线图

精密度：精密吸取芦丁标准溶液6份，每份130 μL，按芦丁标准曲线的绘制方法测定吸光度。结果吸光度的RSD=0.32%，表明该方法、仪器的精密度较好。

稳定性：取样品溶液按上述方法制备并每隔10 min按芦丁标准曲线的绘制方法测定一次吸光度，记录60 min内样品溶液吸光度值，计算RSD值。结果表明该供试品在60 min内保持稳定，RSD值为0.72%。

重复性：取同一批样品6份，配置溶液，按芦丁标准曲线的绘制方法测定吸光度。结果显示RSD=0.65%，表明该测定方法重复性好。

提取物中总黄酮含量的测定：将部分样品溶液各自稀释相应倍数，取130 μL的样品溶液，加入40 μL5%的NaNO2，混匀静置6 min，加入 40 μL 8%的AlCl3，混匀静置6 min，加入 290 μL 5%的NaOH，混匀静置15 min。在510 nm处测量吸光度，由芦丁标准曲线计算总黄酮浓度。计算无舌川西小黄菊中总黄酮含量为5.16%，RSD为0.87%。

2.6 无舌川西小黄菊提取物抗氧化活性测定 样品配制：电子天平分别精确称取W1和W2，加入乙醇配制成一系列浓度梯度的溶液。精确称取一定的DPPH，用甲醇溶解配置成1 mmoL/L DPPH甲醇溶液。精确称取一定的维生素C，配置成维生素C标准品溶液。

清除DPPH自由基能力测定：将样品稀释成不同倍数制成不同浓度的样品溶液，加入 200 μL 1 mmoL/L DPPH甲醇溶液，用甲醇补至300 μL体积，避光室温反应30 min，以甲醇溶液做空白对照用酶标仪在517 nm处测量吸光度，记作A1。甲醇替代DPPH测吸光度记作A2，甲醇替代样品测空白吸光度记作A0。则其自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。以维生素C(Vc)标准品溶液为阳性对照。每一浓度做3个平行样，取平均值。

由图2可知，无舌川西小黄菊提取物和维生素C均显示了较强的清除DPPH自由基能力，且均显示出随浓度增大清除率增大，到一定浓度清除率趋于稳定。其中维生素C的清除能力在各个浓度均最强，其IC50值为0.34 mg/mL，且趋于稳定后抑制率达到90%；与W2相比，W1清除DPPH自由基能力呈现出两头弱，中间高的趋势，其IC50值为0.84 mg/mL，趋于稳定后抑制率达到78%；相对于W1，W2清除DPPH自由基能力呈现出两头强，中间低的趋势，其IC50值为0.54 mg/mL，趋于稳定后抑制率达到82%。说明总体上W2清除DPPH自由基能力要强于W1。

图2 无舌川西小黄菊提取物(总黄酮浓度)及维生素C对DPPH自由基清除能力图

2.7 无舌川西小黄菊精油成分分析 样品配制：取无舌川西小黄菊精油0.1 mL，加入适量乙醚稀释，进行GC-MS分析。升温程序：初始柱温为60 ℃，保存2 min，然后8 ℃/min升温至220 ℃，保存10 min。载气为氦气，流速为1.0 mL/min，不分流进样，进样体积为1 μL。EI电离源，电子能量：70 eV；质量扫描范围：40～400 amu。

通过以上色谱条件对无舌川西小黄菊精油进行分析，得到总离子流图(TIC)。如图3所示，共分离出37种物质。利用 NIST2005和Wiley275标准谱库进行检索共鉴定出30个组分，占总量的48.99%。主要成分为吉马酮(12.15%)、古芸烯(5.63%)、摩勒烯(3.45%)等。但保留时间为8.856(0.36%)、17.874(37.63%)、17.938(2.05%)、18.120(2.93%)、18.907(0.30%)、21.372(4.92%)、21.708(2.82%)的七个主要成分未能鉴定出，尤其是17.874分钟的组分在精油中含量最高(37.63%)，它们的结构值得未来进一步研究。

表7 无舌川西小黄菊精油成分的GC-MS测定结果

表7(续)

图3 无舌川西小黄菊精油化学成分总离子流图

3 讨论

无舌川西小黄菊在怒族民间用于高血压、风湿类疾病、刀伤或跌打损伤的治疗，但是其药理学依据尚未有研究报道。NO作为一种神经递质，参与了炎症反应的过程，是各种炎症疾病发生的促炎因子。测试了其粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2的抗一氧化氮生成活性。结果表明，粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2均显示出显著的抗一氧化氮生成活性，其中W2的活性明显强于紫茎泽兰提取物及报道的抗炎单体二萜的活性，暗示其中含有丰富的强抗炎活性的化合物。无舌川西小黄菊在怒族民间用于风湿类疾病的治疗，而炎症是风湿疾病的主要症状，实验结果与该植物的民间药用功效是一致的，从而为其民间用药提供了现代药理学依据。这一实验结果也与其原种川西小黄菊报道的抗炎镇痛活性一致，说明这两种植物都含有大量具有抗炎活性的化合物。对无舌川西小黄菊的精油进行了分析，发现其中含有吉马酮等成分，而吉马酮报道有抗炎、抗氧化等活性[15]，暗示吉马酮可能为其活性成分。进一步的化学成分研究结合药理学实验有望从中发现新的抗炎候选药物。

血小板在止血过程中发挥着重要作用，而血小板活化、聚集是其发挥止血作用的前提。无舌川西小黄菊在民间多用于刀伤止血作用，因此测试了其粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2诱导血小板聚集活性。然而实验结果表明，无舌川西小黄菊提取物并没有显示出血小板聚集活性。考虑到止血机制比较复杂，而血小板聚集只是其中的一种，有可能无舌川西小黄菊通过其他机制发挥止血功能，例如形成凝胶状物质堵塞血管以加速凝血过程等[16-17]。其潜在的止血机制还有待未来的研究加以揭示。

无舌川西小黄菊和川西小黄菊在民间都有治疗跌打损伤和活血化瘀的用途，这提示可能具有抗血小板凝聚的功能。据此，测试了无舌川西小黄菊粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2的抗凝血活性。经测试它们对内源性凝血途径、外源性凝血途径和共同凝血途径的影响，结果表明，无舌川西小黄菊的提取物只显示了微弱的抗凝血活性。因此，无舌川西小黄菊在民间用于治疗跌打损伤与其活血活性关系不大。据报道[7]，川西小黄菊具有镇痛活性，虽然无舌川西小黄菊这方面的活性在本次实验中并没有加以研究，有可能该植物也具有一定的镇痛活性，从而被民间用于治疗跌打损伤。

川西小黄菊的主要化学成分是黄酮类化合物，因此课题组对无舌川西小黄菊的总黄酮含量进行了测定。结果表明其总黄酮含量达到5.16%，与其原种川西小黄菊总黄酮含量相当[7]。由于黄酮类化合物多具有抗氧化、清除自由基的功能，课题组对舌川西小黄菊粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2的DPPH自由基清除能力进行了研究，结果表明W1和W2都具有良好的清除自由基能力，它们的IC50值分别为0.84 mg/mL和0.54 mg/mL。

综上所述，无舌川西小黄菊的提取物具有显著的消炎和清除自由基的活性，这为从中发现新的消炎候选药物奠定了基础。其原种川西小黄菊作为著名的藏药，目前面临着资源过度开发，濒临枯竭的困境[6]，对其变种无舌川西小黄菊的药理学研究，发现它们具有类似的药理学活性，为其作为藏药川西小黄菊的替代品提供了依据。无舌川西小黄菊作为我国少数民族聚集区怒江州常见的野生植物，其进一步开发对于有效利用资源，科学高效扶贫具有一定的积极意义。