水环境中致病菌快速检测技术及应用研究进展

邓 闵，李 露，宋 康*

1.南方海洋科学与工程广东省实验室（广州），广东 广州 511458

2.中国科学院水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北 武汉 430072

近年来，水环境中的生物污染事件频发，对人体健康造成了严重威胁[1-2].其中，水体致病菌导致的相关疾病是全球范围内的重大公共卫生问题.为及时反映生物污染的现状并预测其未来发展趋势，需要应用高效、准确的致病菌检测方法[3-5].我国现行的《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)、《城市污水再生利用景观环境用水水质》(GB/T 18921-2002)和《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)仅将粪大肠杆菌群、耐热大肠菌群和总大肠菌群等指示微生物作为评价水体微生物污染的指标.然而，研究表明环境样本中主要致病菌的丰度并不总是与指示菌的丰度成正比[6]，传统的指示菌方法可能无法准确反映天然水体中致病菌的真实污染状况，需要直接检测原水中特定的致病菌，控制生物风险[7].

目前我国环保部门常采用多管发酵法检测水中大肠杆菌(Escherichiacoli)[8]，然而该方法无法区分致病性和非致病性菌株，且无法鉴定大肠杆菌携带的毒素基因[9].此外，传统的细菌培养和生化鉴定等检测方法操作繁琐，通常需要48～72 h 才能得到结果，且灵敏度较低，容易产生假阳性和假阴性结果[10].随着分子生物学技术的不断发展和进步，利用这些技术快速检测水体致病菌已成为不可逆转的趋势[11].PCR(polymerase chain reaction)是一种通过模拟DNA 的天然复制过程，在体外快速扩增特定DNA 片段的分子生物学技术，在此基础上，发展出了多重PCR 技术、qPCR(荧光定量PCR)和微流体qPCR 技术(见图1)[12-19].此外，还包括生物传感器、微阵列、LAMP(loop mediated isothermal amplification)、数字PCR 和基因编辑在内的分子生物学技术(见图1).其中生物传感器作为水体致病菌快速检测技术，种类众多，已有国内外综述进行了系统的报道[20-21]，本文不再论述.本文主要介绍了分子生物学快速检测方法在环境水体致病菌检测中的应用现状，重点关注技术推广应用时的效率、经济性以及是否需要专业技术人员等问题，而对于不同技术本身的不足可以参考已有报道[22]；进一步梳理了应用这些检测方法进行QMRA(quantitative microbial risk assessment)的方法并给出建议.这对在全国或区域范围内建立高风险致病菌在线监测和自动快速预警系统具有重要参考价值.

图1 环境水体致病菌检测技术的发展历程Fig.1 The developmental trajectory of pathogenic bacteria detection technologies in environmental water bodies

1 致病菌分子生物学快速检测技术

1.1 荧光定量PCR 技术

qPCR 技术是一种在PCR 反应体系中引入荧光标记的方法，通过特异性引物与目标DNA 结合，利用荧光信号的积累实时监测扩增产物量的变化，并绘制成扩增曲线.该技术具有高特异性、高灵敏度、准确定量以及耗时短的特点(见表1)[9,11,23-24].美国环境保护局已推出了基于qPCR 的肠球菌属(Enterococcusspp.)标准化快速检测方法(US EPA method 1609.1)，并被广泛应用于环境水体致病菌检测[40].由于引物扩增条件的不同，qPCR 通常一次只能检测一种致病菌.近年来，有研究通过对引物和探针进行优化，使qPCR反应条件一致，从而实现了对环境水体33 种病原微生物和10 种不同粪便污染标记基因的同时检测，自动加样芯片的使用也降低了人员培训难度[41].

表1 不同致病菌检测方法及其检测限Table 1 The detection methods for pathogens and their detection limits

对比qPCR 和传统膜过滤培养法检测结果发现它们在时间和空间上都展现出相同的变化趋势，因此qPCR 适用于环境水体致病菌的定量检测[24].有研究应用qPCR 调查了秦皇岛滦河口海域以及大亚湾海域致病菌丰度的季节性变化，发现大肠杆菌和肠球菌分别是大亚湾海域和滦河口海域的主要致病菌，并探讨了致病菌与环境因子之间的相关性[42].qPCR 技术可以有效区分致病毒株和非致病菌株.有研究分别根据痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)侵袭性毒力基因ipaH以及病原性大肠杆菌eaeA、rfbE毒力基因设计了引物，并用于环境水样中致病菌株的快速检测[11,43].例如，对北京某地饮用水处理过程中不同阶段水样的检测表明，水源水约有10%的样本中有痢疾志贺菌，此外，在水厂消毒后直至用户使用水的过程中，存在潜在的痢疾志贺菌污染风险[23].qPCR 技术还可以区分活性和非活性的致病菌.PMA(propidium monoazide)可以抑制死亡细胞的DNA 扩增，与qPCR结合可以选择性地监测水环境中有活性的大肠杆菌[44].此外，由于RNA 在环境中不稳定，也可以被用作判断活性致病菌存在的分子信标，逆转录qPCR 技术可用于环境中活性致病菌的监测[9,45].总体上，qPCR 技术检出限低，且有优异的特异性和抗干扰能力，但相应的仪器设备价格昂贵，限制了其在水体致病菌检测中的应用(见表2)[11].

表2 不同致病菌检测技术优势与不足Table 2 Advantages and limitations of different pathogen detection technologies

1.2 微阵列技术

微阵列技术，也被称为DNA 芯片，是通过机械系统将大量DNA 探针固定在硅片等支持物上，在严格的条件下与待检测物质的核酸序列进行互补配对的杂交反应，通过检测荧光信号或其他标记物来分析反应结果.通过固定特异性的探针，可用于病原微生物血清型、基因型的检测以及基因表达谱的分析.有研究设计了全部指示性微生物的DNA 芯片，与标准培养法结果进行比较验证，表明DNA 芯片是检测水体致病菌的有效工具[46].

微阵列技术检测通量大(见表2)，可实现对24种常见的环境水体致病菌以及指示性微生物[25]，甚至是地下水中941 种致病菌[47]的同时检测.然而该技术的检测限较高，数量级通常在104CFU/样本水平[25]，利用小亚基rRNA 基因序列进行优化，可以将检测限降至103genes/样本[48]，但依然比qPCR 高出2 个数量级(见表1).因此，需要采取一些预处理方法来克服环境水样中致病菌丰度低的问题.例如，可以通过过滤100 mL 水后将滤膜保留的细菌污染物进行预培养，或者将过滤水体的体积增加10 倍，从而增加主要病原指示微生物的检出率[46].有研究应用微阵列技术检测港口航道致病菌，特异性地检测出了多种弧菌、阴沟肠杆菌(Emterobacter cloacae)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)[26](见表1).总体而言，DNA 微阵列的检测通量极高，然而其灵敏度有待进一步提高.此外，目前微阵列技术的探针设计依赖于有限的经公开验证的DNA 序列，且其检测成本较高，限制了其在大规模环境检测中的应用(见表2).

1.3 微流体qPCR 技术

微流体qPCR(Microfluidic qPCR)技术是一种在微流体芯片中进行qPCR 的技术，它将传统的qPCR反应体系缩小到微尺度，在微通道中实现高通量的PCR 反应.微流体qPCR 技术具有同时处理多个样品和多个目标致病菌的能力(见表1).有研究利用20个PCR 反应条件相同的TaqMan 探针开发了可以同时检测池塘水体样本中10 种肠道致病菌和1 种粪便指示菌的微流体qPCR 技术[28].为了校正微流体qPCR技术定量过程中由于DNA 不能100%回收所导致的致病菌检出值偏低的问题，有研究创新性地通过基因工程制造并引入SPC(sample process control strain)至水样处理过程[49].通过计算不同致病菌和SPC 回收效率比值，从而在测定实际水样中致病菌时通过加入SPC 进行校正，更加准确地检测了环境水体中的致病菌丰度[49].此外，微流体qPCR 设备和芯片的制造成本较高，这可能限制了其在偏远地区的推广应用.为解决这一问题，有研究构建了非封闭反应池的微流体qPCR 芯片，使得可以方便地手动添加不同引物对，从而降低检测成本[29].综合来看，微流体qPCR技术相比传统qPCR 技术降低了样本量并增加了检测通量，其灵敏度也较传统qPCR 技术更高，但不同研究之间存在较大差异[28-29,49]，且仍需进一步降低使用成本(见表2).

1.4 数字PCR 技术

数字PCR(Digital PCR)技术是一种建立在多个微小反应区域上的PCR 技术，能够将单个DNA 分子扩增为数百万个复制物.与传统的qPCR 技术不同，数字PCR 技术不依赖标准曲线或外部校准品来确定目标DNA 的浓度，而是通过将样品分成许多微小反应区域，在每个区域中进行扩增，然后通过计算阳性和阴性反应的比例来定量目标DNA 的含量[50].在对海滩娱乐用水和雨水中与污水相关的拟杆菌属(Bacteroides)HF183 标记基因进行监测时发现，数字PCR 技术和qPCR 技术具有相似的诊断敏感性和特异性[50]；而检测在饮用水中接种的已知浓度肺炎军团菌(Legionella pneumophila)时发现，数字PCR 技术相比逆转录PCR 技术其精确度更好，重复性更高[51].采用混凝和泡沫分离法将环境水样浓缩1×104～5×104倍，可以显著提高数字PCR 技术对环境水体致病菌的检测灵敏度，检测耗时可以控制在60 min 以内(见表1)[30].另外，微液滴数字PCR 技术对抑制物具有较高的耐受性，在抑制物浓度比qPCR 技术所能容忍的浓度高出1～2 个数量级时，对定量结果没有明显影响[50].总体而言，数字PCR 技术相较于qPCR 技术在灵敏度、精确性和可重复性方面具有优势，然而，其使用需要更加昂贵的检测设备、更专业的分析人员以及更高的样本分析成本(见表2).目前，数字PCR技术在医院致病菌的检测方面有所应用，而在偏远地区和环境样本大规模检测方面的应用较为有限.

1.5 多重PCR 技术

多重PCR 技术是一种在同一反应体系中加入多个特异性引物，并通过调节退火温度来同时检测多种致病菌或同一致病菌的不同基因型的方法，能够节省时间和成本，提高检测效率，适用于大批量样品在分子水平上进行高通量检测的需求[52].由于多重PCR技术中使用了多套高度特异的引物，引物设计成为非常关键的一步.这些引物应具有相似的退火温度，以确保多重PCR 技术能够成功进行.此外，如果多个扩增产物大小接近，结果将很难解读(见表2).由于这些限制条件，多重PCR 技术一次性分析致病菌的目标基因数远小于微阵列技术(见表1).近年来，已开发出了水体中多种致病菌的多重PCR 技术[6,31-33].然而，相较于qPCR 技术，多重PCR 技术的检测时间明显延长，需要5～12 h.多重PCR 技术的检测限也比单重qPCR 技术低1～2 个数量级(见表1)[6,31-33].有研究试图通过增加扩增循环数和热启动酶量来提高多重PCR 技术的灵敏度，但结果不理想[31]，这可能是因为在多重PCR 技术中，多个目标序列同时进行扩增，导致竞争，从而降低了扩增效率.尽管如此，在应用多重PCR 技术检测天然水体中的致病菌时，仍能获得清晰、稳定、特异且一致的结果[32-33].总体上，未来多重PCR 技术需要考虑开发专门的引物设计软件和智能算法来辅助引物的选择和优化，同时改进检测平台，提高多重PCR 技术的检测灵敏度.

1.6 环介导等温扩增技术

LAMP 技术借助具有高置换活性的bstDNA 聚合酶，采用4～6 条特异性引物，能够在恒温条件下快速扩增目标基因[18].该技术不依赖大型设备，可通过肉眼可视的显色反应、实时浊度仪和荧光信号三种方式对扩增结果进行检测，操作简便，因此适用于野外实地检测.对水体常见致病菌的LAMP 引物和反应条件进行优化后，可在45 min 内完成检测，最低检测限为100 copies/样本[7].传统基于管式的LAMP 技术检测过程易受气溶胶扩散污染的影响，从而可能导致假阳性结果.因此，有研究开发了一种基于分子信标的LAMP 检测方法，通过引入信标来校正传统LAMP 检测方法中可能存在的假阳性结果[34].该方法被用于快速和特异性地检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，丰度检测限为1 cell/(100 mL)，检测时限为1 h[34].

LAMP 技术可与微流控芯片技术相结合，具有高度集成化的优势.已有研究利用LAMP 技术设计芯片，可以一次性检测水体致病菌的多个毒力和标记基因[35]；通过将LAMP 技术与MPN(most probable number)方法结合构建微芯片，可以在不需要提取核酸的情况下直接检测水体中的致病菌[36].微流控芯片与实时成像系统的结合可能成为开发廉价便携的现场筛查多种环境水体致病菌的关键技术.已有研究通过基于LAMP 技术的微芯片与低成本的电荷耦合器件荧光成像系统相结合，能够更加便利地快速检测6 种环境水体致病菌[37].LAMP 技术与微流控芯片相结合可以缩短检测耗时，降低检测限(见表1).一般检测耗时小于20 min[35-37]，是商业PCR 方法检测时间的一半，检测限低至1 copy/样本[32]或<10 CFU/样本[36].总体上，LAMP 技术是一种快速、敏感且低成本的致病菌诊断系统，但其引物设计复杂，需要研究人员针对不同致病菌现行建立标准化的检测流程用以推广应用(见表2).

1.7 基因编辑技术

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)相关的蛋白系统是自然界中细菌和古细菌抵御噬菌体感染和质粒转移的一种防御机制[19].基因编辑技术依赖于CRISPR RNA(CrRNA)引导的Cas12a(DNA)和Cas13(RNA)酶的切割能力[8].为了检测切割反应，可以与荧光探针、胶体金试纸条等方法联合应用.由于CRISPR/Cas 系统具有特异性好、灵敏度高、检测便捷等优点，再加上Cas12a 对DNA具有靶向性，因此近年来已有研究将CRISPR/Cas12a系统应用在环境水体致病菌的早期诊断和现场快速检测等领域[8,38-39,53].

CRISPR/Cas12a 系统通常与其他技术结合来实现对致病菌的检测.结合CRISPR/Cas12a 与可逆阀辅助芯片，可快速便捷地检测副溶血性弧菌[38].通过优化裂解缓冲液、LAMP 试剂和CRISPR 试剂，从采样到获得结果可以在50 min 内完成[38].结合重组酶辅助扩增检测和CRISPR/Cas12a 系统可快速敏感地诊断创伤弧菌[39]和致病大肠杆菌O157∶H7[8].利用CRISPR/Cas12a 放大荧光信号，可以实现超高灵敏度的致病菌检测，如检测限达到2 copies/样本的创伤弧菌[39]和1 CFU/mL 的大肠杆菌O157:H7[8].结合LAMP和重组酶辅助扩增等恒温扩增方法与CRISPR/Cas12a技术，无需复杂仪器，且检测迅速，低至40 min(见表1)[39].然而，基因编辑技术需要事先了解目标致病菌的基因组序列，其CRISPR/Cas 系统的设计需要专业技术人员(见表2).

2 介水传播疾病的定量微生物风险评估

2.1 QMRA 评估方法

QMRA 是一种系统的定量评估过程，被用于估计人类暴露于特定病原微生物时的健康风险或疾病发病率.该方法结合了感染的剂量-反应信息和暴露途径的分布信息，能够确定饮用水分配系统是否达到健康目标.这些健康目标建议每年每万人感染率小于1 次，或者每人每年患病负担为10-6伤残调整寿命年(disability adjusted life year)[54].QMRA 有助于预测介水传播疾病的风险，设定可接受的介水传播疾病每年每万人感染率限制，找出降低疾病感染风险的方法，并确定保护水安全的措施.

风险评估包括风险识别、暴露评估、剂量-反应评估、风险表征和风险管理及沟通5 个步骤(见图2).其中病原菌的暴露途径主要为经口摄入，也有部分病原菌通过眼睛接触传染[55]，据此，通过水中致病菌丰度与单位时间内暴露体积及单次暴露时间长度的乘积计算暴露剂量(D)，根据不同致病菌的剂量-反应模型分别计算Pd(每日感染概率)，则年度感染概率Py=1-(1-Pd)f，其中f为暴露频率(d/a)[56].相比于定性评估方法，QMRA 提供了更准确、可比较的结果，有利于决策者理解和比较不同风险源的风险水平，并制定管理策略.

图2 定量微生物风险评估(QMRA)流程图Fig.2 Flow diagram for quantitative microbial risk assessment (QMRA)

2.2 QMRA 在环境水体致病菌风险评估中的应用

QMRA 依赖于水中致病菌的监测方法，目前QMRA 方法主要基于通过培养方法获得的数据，已经被用于评估不同天气条件下冲浪和游泳后海滩娱乐水域[57]、受人源和非人源粪便污染的娱乐水体[58]、受污染的城市洪水[59]以及低收入地区较差的饮用水水质[60]所带来的公共健康风险.然而，仅依靠培养方法无法完全表征风险，因为存在VBNC 状态的细菌[61]，而且许多环境水体致病菌在自然样本中很难甚至无法被培养出来.此外，一些培养方法可能无法区分致病菌的基因型，如使用常规的大肠杆菌培养基无法区分出O157:H7 株型.

随着分子生物学方法在微生物检测中的广泛应用，如何有效利用这些数据来进行QMRA 变得至关重要[62].有研究应用qPCR 定量分析的城市景观娱乐水体中致病菌丰度数据进行了QMRA[55].然而，目前针对不同致病菌的剂量-反应模型参数多是根据传统培养法进行拟合获得的，由于qPCR 分子生物学方法可以检测到水体中非活性的病原体，可能过高地估计了水中可传播的致病菌数量，从而导致qPCR 方法计算的感染概率偏大，因此需要进行相应的修正或者针对新型分子生物学检测方法重新建立剂量-反应模型.

2.3 应用分子生物学快速检测技术进行QMRA 的优势和不足

运用分子生物学技术可以更准确地识别致病菌，并在较短的时间内检测到活性微生物，改进对致病菌的表征.相比传统培养方法，除致病菌浓度外，还能够将监测方法所提供的关于致病菌发生、传播程度、毒力乃至存活力等关键信息应用于QMRA 结果的评估中.另外，人力进行QMRA 不能实时评估，而分子生物学技术检测结果多为电子数据，有利于直接创建可访问的数据，结合人工智能模型评估不同致病菌的风险水平，可以实现对区域范围的自动预警，从而提高QMRA 的可行性和应用性.目前，运用分子生物学快速检测技术进行环境水体致病菌QMRA 的主要限制之一是缺乏可用于评估的数据，因此建议在全国范围内设立重点监测站点，以收集长期的监测数据，从而提高预测致病菌污染和保护公共健康的可能性[63].

3 结论与展望

a) 与传统培养方法相比，分子生物学方法在环境水体致病菌的检测方面具有灵敏度高、特异性好和耗时短的优势，但仍然需要进一步降低检测耗时，减少昂贵设备的使用和对操作人员的技术培训要求，同时降低分析成本.

b) 污水、地表水和海水中的腐殖酸、氯化钠等抑制性物质会影响以PCR 为基础的检测技术的扩增效率，需要优化；而饮用水和水源水中致病菌丰度较低，宜应用高灵敏度的检测技术.

c) 分子生物学方法在高通量检测致病菌、检测VBNC 的菌株以及区分致病毒株和非致病菌株等方面具有不可替代的优势.因此，有必要将这些非传统的致病菌特征纳入到QMRA 结果的评估中，通过优化QMRA 评估模型，提高对致病菌污染的预测能力.

d) 尽管已有大量研究建立起了不同致病菌的分子生物学检测方法，然而目前相关水环境质量标准中并未对除了指示微生物以外的致病菌提出明确的检测要求.因此，在环境水体样本致病菌的实际检测中，相关分子生物学技术的应用相当有限，亟需制定水环境中更加广泛的致病菌检测标准.

e) 当前，全球范围内水环境中生物污染事件频繁发生，对人体健康构成严重威胁.应当将人工智能引入公共卫生预警系统中，利用大数据分析和人工智能模型实现自动快速预警，从而更好地预测和应对水环境中的生物污染事件.