BTLA、CTLA-4 基因多态性与肝癌TACE 联合靶向治疗疗效及预后相关性

陆小华，袁洪新

（南通大学附属医院介入放射科，江苏 南通，226001）

肝癌目前在我国是第四大恶性肿瘤，其致死率位居第二，仅次于肺癌，肝癌早期隐匿，疾病进展较快，绝大多数患者确诊时已经处于中晚期或伴有严重肝硬化，此时已经失去最佳手术治疗时机，而介入治疗是其有效替代最佳治疗方案[1-2]。经动脉插管化疗栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）是目前治疗中晚期肝癌患者常用手段，可有效杀伤肿瘤病灶，改善机体免疫功能、生活质量[3]。临床评价TACE 疗效和预后主要依靠影像学数段，从肿瘤数目、大小等表观学方面进行评价[4]，但从微观基因方面评价疗效和预后的研究少见。人类基因组计划研究显示，不同个体间相同基因组序列同源度达99%以上，其余约1%为遗传变异，多见于单碱基改变，即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）[5]。最近研究发现，B 及T 淋巴细胞弱化因子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）、细胞毒性T 淋巴细胞抗原-4（cytotoxicT-lymphocyte antigen-4，CTLA-4）等基因多态性与多种肿瘤易感性密切相关，其基因位点突变可增加肿瘤发生[6-7]。基于以上背景，本研究创新性观察BTLA、CTLA-4基因多态性与肝癌TACE 联合靶向治疗疗效及预后相关性。

1 资料与方法

1.1 病例选择

选取2021 年1 月至2021 年12 月南通大学附属医院介入放射科收治的新发85 例肝癌患者作为研究对象，其中男65 例，女20 例；年龄36～65 岁，平均（52.35±5.34）岁；Child-Pugh 分级：75 例A 级，10 例B 级；BCLC 分期：20 例B 期，65 例C 期。纳入标准：符合《原发性肝癌诊疗规范（2019 年版）》[8]诊断标准，经病理学检查确诊；均行TACE 联合靶向治疗；美国东部肿瘤协作组体能状态评分均为0～1 分；Child-Pugh 分级为A 级、B 级；BCLC 分期为B 期、C 期；TACE 前白细胞≥4.0×109/L、血红蛋白≥8.0 g/L；无全身性感染疾病；近3 个月无免疫抑制、激素药物治疗史。排除标准：大量腹水经治疗后不能消除；近3 个月出现消化道出血；既往存在肝移植、放化疗或系统性等治疗；严重脾功能亢进；其他恶性肿瘤；预计生存期 ＜ 6 个月；免疫系统疾病；妊娠期或哺乳期女性。本研究获得南通大学附属医院医学伦理委员会批准（批号：2020-K024-01）。

1.2 治疗方法

所有受试者均在Innova IGS540 DSA 血管造影X 射线机（美国GE 公司）行TACE 治疗。操作步骤：常规碘伏消毒、1%利多卡因局部麻醉，采用Seldinger 改良法经右侧股动脉穿刺置鞘，置入5F RH 导管至腹腔干、肠系膜上动脉，行碘克沙醇造影，确定肿瘤供血动脉。用Progreat 微导管或Merit 微导管超选进入肝脏肿瘤动脉供血分支中，灌注表柔比星0～30 mg、洛铂20～30 mg化疗药物，予表柔比星10 mg 与碘化油混制乳剂10～25 mL 栓塞，至肿瘤内碘油沉积致密后终止栓塞。最后再次造影，显示肿瘤供血动脉分支栓塞满意后结束手术。所有入组患者均在TACE 治疗后3～7 d 开始口服索拉非尼（400 mg bid）或仑伐替尼（＜ 60 kg 患者，8 mg，qd；≥60 kg 患者，12 mg，qd），如患者出现药物相关严重不良事件则适当减少剂量或停药观察。

疗效评估：治疗1 个月后，根据RECIST 实体瘤疗效评价标准进行疗效评估[9]，完全缓解：肿瘤病灶完全消失，部分缓解：病灶直径减小≥50%，稳定：病灶直径减小 ＜ 50%，进展：病灶直径增加 ＞ 25%或出现新病灶。有效组：完全缓解、部分缓解、稳定；疾病进展组：进展。

1.3 BTLA、CTLA-4 基因多态性检测

采集2 组患者静脉血3 mL，经抗凝处理后，按照DNA 抽提试剂盒（上海生工公司）提取患者DNA，并对其进行检测定量。获取CTLA-4 基因rs231775、rs733618、rs3087243、rs4553808 位点、BTLA 基因 rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859629T 位点，设计并合成SNP 位点扩增引物，PCR 体系如下：2 µL DNA 模板（10 ng/µL），上下游引物各1 µL，15 µL 2×PCR Ready Mix，在PCR 仪进行扩增，程序为：94℃预变性4 min、94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35 次循环，72℃终延伸10 min，4℃保存。反应结束后，采用1%琼脂糖胶电泳检测PCR 产物，确定产物大小，用AMPure XP 磁珠纯化、回收。最后使用HiSeq XTen 测序仪进行测序。采用panel 高通量数据分析基因分型。

1.4 观察指标

（1）比较2 组临床资料，包括性别、肿瘤最大径、年龄、肿瘤数目、BMI、Child-Pugh 分级、BCLC 分期、肝外转移、血管侵犯；（2）分析BTLA、CTLA-4 基因多态性检测结果，CTLA-4 rs231775、rs733618、rs3087243、rs4553808 位点、BTLA rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859 629T 位点均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律；（3）比较2 组BTLA、CTLA-4 基因位点基因型；（4）单因素、多因素分析BTLA、CTLA-4 基因多态性与疗效的相关性；（5）比较不同BTLA、CTLA-4 基因位点基因型患者生存预后状况；（6）单因素、多因素分析BTLA、CTLA-4 基因多态性与生存预后的相关性。

1.5 统计学处理

临床病历资料收集使用EXCEL 2019，数据处理使用软件SPSS 25.0，计数资料用n（%）表示，采用χ2检验，等级资料用Ridit检验；计量资料呈方差齐性、近似服从呈正态分布以（）表示，采用t检验；采用K-M 法绘制生存曲线，单因素、Logistic 多因素回归分析BTLA、CTLA-4 基因多态性与疗效、预后相关性。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组临床资料

2 组年龄、性别、BMI 差异无统计学意义（P＞0.05）；肿瘤最大径、肿瘤数目、Child-Pugh 分级、BCLC 分期、肝外转移、血管侵犯差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表1。

表1 2 组临床资料比较[n（%）/（）]Tab.1 Comparison of clinical data between two groups [n（%）/（）]

表1 2 组临床资料比较[n（%）/（）]Tab.1 Comparison of clinical data between two groups [n（%）/（）]

*P ＜ 0.05。

2.2 BTLA、CTLA-4 基因多态性检测结果

经 TaqMan qRT-PCR 检测显示，BTLA rs2171513 位点基因型为GG、GA、AA；rs3112270位点基因型为AA、AG、GG；rs1982809 位点基因型为GG、GA、AA；rs16859629T 位点基因型为TT、TC、CC；CTLA-4 rs231775 位点基因型为GG、GA、AA；rs733618 位点基因型为CC、CT、TT；rs3087243 位点基因型为GG、GA、AA；rs4553808 位点基因型为AA、AG、GG。经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，随机选取10%样本进行基因测序验证，使用SeqMan 软件查看测序结果，证实上述位点存在基因多态性。

本研究85 例患者CTLA-4 rs231775、rs733618、rs3087243、rs4553808 位点、BTLA rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859629 位点基因型分布情况，见表2。经符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验，具有人群代表性。

2.3 2 组BTLA、CTLA-4 基因型分布情况

2 组 BTLA rs2171513、CTLA-4 rs733618、rs4553808 位点基因型分布情况差异无统计学意义（P＞ 0.05）；治疗有效组BTLA rs3112270 位点AG、GG 基因型比例、rs1982809 位点GA、AA比例、rs16859629 位点CC 基因型、CTLA-4 rs231775 位点AA 基因型比例、rs3087243 位点GA、AA 基因型低于疾病进展组，BTLA rs3112270位点AA 基因型比例、rs1982809 位点GG 比例、rs16859629 位点TT 基因型、CTLA-4 rs231775 位点GG 基因型比例、rs3087243 位点GG 基因型高于疾病进展组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表3。

2.4 BTLA、CTLA-4 基因多态性与疗效的相关性

在进行Logistic 多因素回归分析时，将肿瘤最大径、肿瘤数目、Child-Pugh 分级、BCLC 分期、肝外转移、血管侵犯等其他混杂因素进行校正。经单因素、Logistic 多因素回归分析显示，BTLA rs2171513G ＞ A、CTLA-4 rs733618C ＞ T、rs4553808A ＞ G 与疗效无关（P＞ 0.05）；BTLA rs3112270A ＞ G、rs1982809G ＞ A、rs16859629T ＞C、CTLA-4 rs231775A ＞ G、rs3087243G ＞ A 与疗效相关（P＜ 0.05），见表4。

2.5 不同BTLA、CTLA-4 基因型患者生存预后状况

85 例患者随访18 个月，脱落3 例，生存率为 68.29%（56/82）。KM 曲线分析，BTLA rs2171513、CTLA-4 rs733618、rs4553808 位点不同基因型患者随访18 个月生存率差异无统计学意义（P＞ 0.05）；BTLA rs3112270 位点AA、AG 基因型患者18 个月生存率高于GG 基因型患者，rs1982809 位点GG、GA 基因型患者18 个月生存率高于AA 基因型患者，rs16859629 位点TT 基因型患者18 个月生存率高于TC、CC 基因型患者（P＜ 0.05）；CTLA-4 rs231775 位点GG、GA 基因型患者18 个月生存率高于AA 基因型患者、rs3087243 位点GG 基因型18 个月生存率高于GA、AA 基因型患者，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表5、图1～2。

图1 不同BTLA 位点基因型患者生存曲线Fig.1 Survival curves of patients with different BTLA loci genotypes

图2 不同CTLA-4 位点基因型患者生存曲线Fig.2 Survival curves of patients with different CTLA-4 genotypes

表5 不同BTLA、CTLA-4 基因型患者生存预后状况比较Tab.5 Comparison of survival and prognosis of patients with different BTLA and CTLA-4 genotypes

2.6 BTLA、CTLA-4 基因多态性与生存预后的相关性

在进行Logistic 多因素回归分析时，将肿瘤最大径、肿瘤数目、Child-Pugh 分级、BCLC 分期、肝外转移、血管侵犯等其他混杂因素进行校正。单因素、Logistic 多因素回归分析显示，BTLA rs2171513G ＞ A、CTLA-4 rs733618C ＞ T、rs4553808A ＞ G 与生存预后无关（P＞ 0.05）；BTLA rs3112270A ＞ G、rs1982809G ＞ A、rs16859629T ＞C、CTLA-4 rs231775A ＞ G、rs3087243G ＞ A 与生存预后相关（P＜ 0.05），见表6。

表6 BTLA、CTLA-4 基因多态性与生存预后的相关性Tab.6 Correlation between BTLA and CTLA-4 gene polymorphism and survival prognosis

3 讨论

TACE 是治疗中晚期肝癌的首选治疗手段，与静脉滴注或口服化疗药物不同，TACE 是利用股动脉插管至肝动脉，将化疗药物送入行局部治疗并进行栓塞，可有效提高病灶组织药物浓度，阻断肿瘤血供，提高治疗率[10-11]。临床有关TACE 后治疗疗效和疾病预后评估方法较多，主要采取实验室指标和影像学等，从宏观和表观学方面对其进行评估[12]。

近年研究证实，遗传易感性可影响肝癌发生发展，迄今为止，研究学者发现在人类基因组中约有一千万个SNPs，平均每100～300 个碱基对有一个SNPs 位点[13]。大量遗传学研究发现，一些基因SNPs 与疾病、肿瘤易感性、疗效评估、预后有关[14-15]。BTLA 是免疫蛋白超家族成员，也是第3 个被发现免疫抑制受体，主要位于细胞膜表面，定位在3 号染色体3q13 区域，结构与CTLA-4、程序死亡因子-1 的抑制因子类似，主要通过调节T、B 淋巴细胞、DC 细胞、巨噬细胞等表达，在T 淋巴细胞活化阶段发挥负性调控作用[16]。正常情况下，BTLA 可与配体结合，进而抑制淋巴细胞过度活化，以防止自身免疫系统损伤；体内免疫功能一旦失衡，BTLA 可通过介导Th1/Th2 细胞平衡、CD8+T 细胞毒性，促进细胞释放过量炎性因子，进而加重疾病进展[17]。目前有文献报道，BTLA 基因多态性与肿瘤发生具有明显关联性[18]，如Fu 等[19]学者发现，BTLA rs1844089 C ＞ G、rs2705535A ＞ G 位点可增加乳腺癌发生风险。王居巳[20]研究显示，BTLA rs1982809 G ＞ A、rs16859629 T ＞ C 基因多态性可增加非小细胞肺癌细胞易感性，但rs2171513 G ＞A、rs3112270 A ＞ G 可降低非小细胞肺癌易感性。本研究通过分析BTLA rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859629T 位点，发现2 组BTLA rs3112270、rs1982809、rs16859629 位点基因型比较，差异显著，进一步分析发现，BTLA rs3112270 A ＞ G、rs1982809 G ＞ A、rs16859629 T ＞ C 与肝癌疗效、预后密切相关。先前有报道显示，接受铂类药物化疗可损伤患者DNA，引起碱基序列改变，导致基因对DNA 损伤修复不及时，不能及时修复化疗药物引起的NA 损伤，增加化疗药物耐药性，影响治疗效果[21]。本研究中TACE 联合靶向治疗，化疗药物采用表柔比星、洛铂，前者为细胞周期非特异性药物，可迅速进入细胞核与DNA 结合，有效抑制核酸合成和有丝分裂进程，阻止RNA 合成；而后者是第3 代铂类化疗药物，不仅影响DNA 合成、复制，还可影响原癌基因c-mye 表达。

CTLA-4 是T 淋巴细胞表面较为重要共刺激基因，与CD28 属同一家族，主要位于染色体2q33 区域，可与CD28 竞争结合B7-1/B7-2 分子，从而发挥负向调节T 淋巴细胞增殖分化作用，还可抑制细胞因子分泌、阻止细胞周期进展[22]。CTLA-4 也是肿瘤免疫检查点基因，在肿瘤免疫过程中发挥重要作用，目前已有研究显示，CTLA-4 基因多态性与肿瘤、自身免疫疾病遗传和环境易感性中存在关联性，可增加肿瘤、疾病患病风险[23-24]。如Liu 等[25]研究显示，CTLA-4 rs231775与转移性肾细胞癌疗效、预后密切相关。Qin等[26]通过分析CTLA-4 rs231775、rs3087243、rs4553808、rs5742909、rs733618 位点，发现rs733618 GG 位点与骨髓瘤疗效、预后密切相关。本研究显示，2 组CTLA-4 rs231775、rs3087243位点基因型差异比较，存在明显差异，单因素和多因素分析显示，CTLA-4 rs231775A ＞ G、rs3087243G ＞ A 与疗效、预后相关，这与Qin 等[26]研究结果不一致。分析原因：可能是因为2 种化疗方式、化疗药物、CTLA-4 基因位点较多等有关，机体内基因调控机制较为复杂，相同基因位点在不同肿瘤中表现不一。

综上所述，本研究证实BTLA 基因rs3112270、rs1982809、rs16859629 位点、CTLA-4 基因rs231775、rs3087243 位点多态性与肝癌TACE 联合靶向治疗疗效、预后存在相关性，测定相关基因型可为临床制定治疗方案提供参考依据。因样本量偏少，不可避免存在选择偏倚。在今后的研究中我们将扩充样本量，以期取得更有说服力的结果。