MSC 来源外泌体治疗缺血性脑卒中机制及进展

曹诗杰 ，安红伟

（1）广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001;2）柳州市中医医院脑病科，广西 柳州 545001）

脑部缺血性疾病是临床上常见的疾病之一，其中缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）则是一种常见的损伤形式。在缺血性脑卒中中扮演重要角色。缺血诱导的炎症级联反应加剧组织器官损伤，故减轻炎症反应和促进血管生成是保护组织器官免受卒中损伤的主要途径。目前研究[1]表明间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）表达趋化因子受体感知炎症信号使炎细胞向炎症部位迁移、释放细胞因子以抑制炎症反应，同时表达生长因子以促进血管愈合并介导细胞凋亡。Zhao 等[2]研究发现，使用来源于间充质干细胞的外泌体进行治疗7 d 后，脑缺血大鼠的记忆、运动和学习能力显著提高。然而间充质干细胞存在移植存活率低、归巢率低、低免疫原性和高致瘤率等不足限制了其在临床上广泛应用。脑损伤的大鼠在使用外泌体治疗后，表现出显著的功能恢复，如轴突重塑、神经生成及血管生成的增多等[3]。临床研究方面[4]也表明外泌体作为干细胞移植的替代方案具有显著的治疗潜力，此外，经过功能化修饰的外泌体能更好地满足治疗需求，从而提高治疗效果。本文为缺血性脑卒中的临床治疗提供全新的治疗思路，揭示了间充质干细胞释放的外泌体在治疗脑卒中方面的作用机制，这一发现揭示了治疗脑血管疾病的新奥秘。

1 脑卒中发生机制概述

在脑缺血再灌注过程中，血液供应受到限制，导致内皮细胞屏障的功能受到破坏，同时，血管的通透性也会受到影响，导致渗出液的增加。缺血缺氧产生炎症反应，激活免疫反应，损伤血脑屏障功能，加重神经元损伤。在中枢神经系统恢复再灌注的早期，脑毛细血管内开始聚集的白细胞引起血流淤积，形成机械损伤及微血栓等，造成下游灌注缺陷及无复流（缺血后血流得到了及时的恢复，但是缺血器官不一定能马上恢复血液灌注）。这些损伤不仅对神经元功能有直接影响，而且这些损伤信号的持续会激活局部或全身炎症反应。此外，再灌注损伤的特征表现为免疫反应的增强和细胞死亡程序的激活，例如脑发生卒中时，脑卒中患者在中枢神经系统损伤和修复反应中都会扰乱免疫平衡，脑卒中触发神经免疫轴的激活，包括驻留在脑实质、软膜和血管床内的免疫系统的多种细胞，以及通过分泌代谢调节物质和招募免疫细胞[5]。在缺氧的情况下，会产生大量的氧化应激，导致活性氧簇增多。同时，Toll样受体4（TLR4）也会被激活，并启动下游核因κB（NF-κB）信号通路[6]。组织缺氧抑制氧敏感的脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylases，PHD），低氧抑制PHD 酶激活NF-kB，促进炎症，缺血期氧化应激经历一系列过程促进细胞凋亡[7]。缺血和再灌注期间的无菌炎症以炎细胞聚集为特征。特别是在再灌注早期，天然免疫细胞在浸润细胞中占主导地位，激活炎症加重组织损伤。而在缺血再灌注后，单核细胞从脾被招募到受损组织中，参与伤口愈合。

2 间充质干细胞特性及外泌体概述

炎症环境中免疫细胞的组成和状态变化会影响MSC 调节炎症的能力，组织驻留的MSC 在恢复受损组织的免疫稳态方面可能不如输注的MSC有效[8]。这种差异的一个可能的解释是，在体外扩增的MSC 通常被大量输入1～2×106/Kg（细胞数/体重），以及在正常状态下，骨髓细胞内干细胞浓度＜0.05×106/Kg（细胞数/体重），远远低于静脉输入的浓度。另外一个潜在的原因是骨髓间充质干细胞在体外扩增时，其免疫功能发生了变化。外泌体（Exosomes）是一种粒径在40～90 nm 之间的脂质膜囊泡[9]。外泌体的生成取决于细胞内部的内部切割体形成。在内部切割体被泛素标记后，它会被降解并封装在囊泡中，形成腔内小泡。这些腔内小泡将会形成多囊泡体，即包含多个小泡的内部结构（multi-vesicular body，MVB）。溶酶体会从多囊泡体中接收这些腔内小泡，并分解其内部内容物为氨基酸和糖类物质，这些降解物又回到细胞质中以便进一步再利用，当腔内小泡内的物质向细胞表面迁移并释放到细胞外部时，这些内容物被称作外泌体，然而目前此机理尚不明确。最后，这些小的细胞外囊泡能够经由表面蛋白的靶向性传递到接受信号的细胞上。当这些囊泡与靶细胞表面粘附时，它们可以与细胞表面的配体及受体相互作用，并被细胞吞噬或内吞，甚至可以与细胞膜融合，将物质输送至细胞内。此外，外泌体还可运载多个信号分子，通过调控靶细胞中的信号转导途径，实现对靶细胞的信息传递，进而影响其生理功能。

3 来源的外泌体对脑卒中的影响研究

3.1 间充质干细胞来源外泌体保护脑卒中抑炎反应

在卒中动物模型中，组织细胞的坏死会引起发炎。炎性细胞浸润、促炎因子聚集是引发炎症的重要原因。初期的炎症反应会把死亡的细胞和细胞碎片都清除掉，同时还会对存活的神经细胞产生进一步的损伤，但是这种损伤会慢慢地被抑制炎症的修复所替代，此时伤口愈合和疤痕形成。而在脑卒中，炎症途径不仅被激活，炎症导致脑血管的脆性增加和凝血失衡，其特征由最初的微血管血栓形成至后脑出血。Zou 等[10]先前的研究指出，在应用骨髓间充质干细胞治疗缺血-再灌注损伤大鼠模型后，大鼠体内的炎性因子，如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）等的表达水平被降低。常驻的小胶质细胞是脑卒中首先感知损伤的免疫细胞，其次是微环境特定的内皮细胞，然后是招募的白细胞。脑缺血后，巨噬细胞会进入大脑并转化为小胶质细胞。在中风的早期阶段，M1 型巨噬细胞的数量也会增多并被募集到炎性区，通过鉴定损伤相关分子在损伤细胞表面的表达或释放，以确定损伤位置并对死亡细胞和细胞碎片进行清除。神经元损伤时，小胶质细胞活化，并上调表面特异性分子，如CD11b、Iba-1、CD40、CD80/86 和主要组织相容性复合体II 类，星形胶质细胞具有分泌作用，可以产生促炎因子，例如单核细胞趋化蛋白-1 和CxC-趋化因子配体，并且也具有分泌抗炎因子的能力，例如转化生长因子-Β、白细胞介素-10（IL-10）等趋化因子或细胞因子。以促进损伤或修复[5]。Zou 等[11]在大鼠缺血1h 后，立即注射间充质干细胞衍生的外泌体，发现在缺血再灌注过程中可以明显提高CX3C 趋化因子配体1（CX3CL1）在组织中的表达。而注射外泌体后下调其表达，CX3CL1 通过与相应受体（chemokine receptor 1，CX3CR1）结合，CX3C 趋化因子配体1可促进巨噬细胞在炎性微环境中的浸润，已证实，来源于外泌体的MSC 可以降低CX3CL1 的表达水平，从而减少巨噬细胞的聚集。进一步的研究表明，miR-16、miR-15a 和miR-15b 等分子可以抑制CX3CL1 的表达，从而阻止促炎细胞在缺血区的聚集[8]。在晚期，M2 型巨噬细胞的数量明显增多，除了分泌抗炎因子外，它们还可以释放多种生长因子。这些细胞在创伤愈合和瘢痕形成过程中发挥着至关重要的作用，并且可以减轻梗死导致的神经元损伤。

经过骨髓间充质干细胞分泌的外泌体逆转作用，可抑制半胱氨酰白三烯受体（CysLT2R）的作用，同时通过胞外信号调节激酶（extracelluar signal-regulated kinase，ERK1/2）调节小胶质细胞的M1 极化，从而显著改善脑损伤。这种作用有助于降低小胶质细胞的炎症反应，并增强促炎因子的减少，同时激活M2 小胶质细胞促进修复，增加CD206 含量，从而保护神经系统免受神经炎症的影响。深入研究表明，这种作用可以导致胞外信号调节激酶（extracelluar signal-regulated kinase，ERK1/2）的表达和磷酸化水平显著降低[2]。Zhao等[12]的研究发现，miR-182 可抑制TLR4/NFκB 信号通路，从而负性调节M1 型巨噬细胞并缓解炎性反应。经过MSC 来源外泌体处理或miR-182 转染后，TLR4/NF-κB 被抑制，而磷脂酰肌醇3 激酶（PI-3K）/蛋白激酶B（PKB）被活化。然而，TLR4/NF-B 与PI3K/Akt 信号通路之间的交互作用机制需要进一步研究。另外，Liu 等[13]的研究表明，在脑缺血后，机体内TLR4 的表达升高，而不是TLR2、TLR7 或是TLR9，同时MSC 及其分泌的外泌体可促进损伤修复。

3.2 间充质干细胞来源外泌体促进脑卒中血管生成机制

研究表明，MSC 释放的外泌体可以对缺血再灌注过程中受损的血管内皮细胞起到保护作用，这种作用是通过活化蛋白激酶B（Akt）实现的[14]。此外，有研究发现[15]，MSC 来源的外泌体中miR-126 的过度表达或敲除会分别增加或减弱MSC 释放的外泌体中Akt 和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化水平。进一步研究表明，MSC 来源的外泌体中的miR-126 可以通过PI3K 信号通路减轻缺血再灌注损伤[16]，这提示MSC 来源的外泌体miR-126 可能通过激活PI3K/Akt/eNOS 途径，提高血小板源生长因子（PDGF）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）的水平，从而维持缺血损伤早期的血管内稳态和功能、增加内皮细胞增殖、迁移、存活和血管生成能力、促进后期血管生成和血管重塑。据报道，MSC 来源miR-126 还可以激活MAPK/ERK 途径，该信号通路有助于下游转录因子Ets-1 的上调，由此推测MSC 来源外泌体可能通过激活MAPK/ERK 通路和上调血管内皮中Ets-1 来增加内源性miR-126 的表达，这有待于进一步的研究。Chen 等[17]研究表明MSC 来源的外泌体miR-150-5p 下调基质金属蛋白酶14（Matrix metallo protein，MMP14）与转化生长因子-β 和VEGF，调节血管稳定性和血管对组织损伤的反应。

3.3 间充质干细胞来源外泌体保护脑卒中凋亡机制

骨髓间充质干细胞及其分泌的外泌体减少了一种催化天冬氨酸羧基侧链切断肽键的半胱氨酸蛋白酶种属中Caspase-3、Caspase-9 和Bax（BCL-2-Associated X 的蛋白质）的表达量，增强BCL-2的表达水平，证实骨髓间充质干细胞及其分泌的外泌体抑制了线粒体细胞凋亡[18]。单独使用外泌体对中风的影响与MSC 相似，这表明外泌体可能是MSC 抗细胞凋亡的重要因素。赵金璇等[19]发现，当TLR4/NF-κB 信号通路失活时，细胞凋亡的关键蛋白酶Alpine-3 的表达也减少。推测MSC 泌体mi-182 通过TLR4/NF-κB 信号通路对脑缺血起到保护作用，抑制血管上皮细胞凋亡。郝海珍等[20]发现，MSC 外泌体显著抑制了大鼠缺血性卒中后细胞色素C（CYP3A）和IL-1β 以及神经元凋亡指数的表达水平。Wang 等[21]发现，MSC 来源外泌体中的C-趋化因子受体2（CCR2）降低了其配体（CCL2）的表达水平，从而达到其对免疫细胞吸引和激活的抑制作用，而MSC 外泌体在下调CCR2 后对缺血再灌注损伤的保护作用明显降低。

4 脑卒中的治疗方法

4.1 现有治疗手段的不足

在脑卒中的治疗过程中发现单纯抗炎的效果并不理想，而且不能有效促进修复途径的激活。鉴于此，近年来干细胞成为治疗卒中的研究热点。然而，静脉输注的间充质干细胞大部分会粘附于毛细血管，真正达到损伤靶组织的量较少，MSC难以输送到卒中病灶，限制其在缺血性卒中治疗中的临床应用，此外，尽管在全身输注后，缺血损伤部位中可能会积聚少量的MSC，但MSC 在炎症和缺氧条件下的存活率很低[22]。这些是干细胞治疗卒中最严重的缺点[23]。除静脉输入MSC 外，侵袭性的脑内输入MSC 可能会对脑组织造成额外损害。与直接输入相比，静脉给药更简单，侵入性更小。

4.2 MSC 来源外泌体在卒中中的的疗效潜力

前期研究发现，来源于间充质干细胞（MSC）的外泌体拥有与MSC 类似的治疗中风的效果。相比之下，外泌体具有以下优势：（1）外泌体的分子质量较小，能够穿过各种组织屏障，包括血脑屏障。由于外泌体为纳米级，因此它们能够穿过肺部毛细血管，有效地预防由于系统输液后导致肺部积液积聚；（2）外泌体治疗方法可以减少干细胞疗法可能带来的危害，包括由免疫原性造成的排异反应和MSC 治疗由于生存率低而造成的治疗效果差等问题[24-25]；（3）外泌体不依赖于血管栓塞，也不依赖于干细胞的分化，它可以自己携带蛋白和核酸，具有比干细胞更加精准的疗效[26]；（4）外泌体的表面标志物CD9、CD63 和CD81 是特定的[27]，这为治疗脑血管病提供了新的机会。增加外泌体与目标组织的相互作用[28]，可以提高它们与脑小胶质细胞的粘附度，最终可轻松地穿透血脑屏障并被脑小胶质细胞有选择性地吞噬[29]；（5）针对需要紧急治疗的患者而言，自体间充质干细胞移植治疗可能并不是最理想的选择。这是因为在进行移植治疗之前，需要进行体外扩增自体间充质干细胞的过程，这个过程非常耗时。此外，通过利用细胞外囊泡可以避免已经发生基因突变或细胞损伤的细胞转移。

总的来说，因为外泌体的纳米尺寸、提供了内部的微环境，使其所含物质能远距离地在体内扩散而不会被分解以及将被传递物质传递至受体细胞的能力，可作为一种有潜力的基因或者药物载体而被广泛应用于临床[30]。

5 小结

外泌体因其特有的优势，已成为脑梗死防治的新靶点。但是，当前外泌体的异质性，也就外泌体的性质随着其来源细胞的种类和状态的差异而发生变化，这给研究人员带来了困扰。为了识别并有选择地分离每种外泌体，需要根据其特性进行分类。此外，还需要将外泌体在培养环境中的影响、将分离方法、干细胞来源和干细胞状态考虑在内，以达到对干细胞的纯化，这也是一个具有挑战性的任务。未来研究的主要方向是如何增强外泌体作为药物传递系统的效率，以更好地为临床医学提供服务。所幸的是，经过改良的外泌体可以部分地解决针对归巢性的问题。例如，将含有Arg-Gly-Asp（RGD）肽的配体引入外泌体表面的修饰，可以增加来自MSC 的外泌体在脑缺血区的聚集[31]。然而，RGD 肽的结合需要多次复杂的化学反应步骤，这可能会对外泌体内蛋白质的功能产生一定的影响。令人可惜的是，MSC 释放的细胞外囊泡数量有限，100 万的间充质干细胞每日产出少于4 µg 的外泌体，这可能会限制它在临床应用方面的使用。既往研究由于剂量和对不同疾病终点的评估不一致，因此较难得出比较可靠的疗效结论。改进分离和产量优化、疗效测定、重复性储存和回收、特定临床适应症的剂量确定等问题也困扰相关科研人员。综上所述，间充质干细胞来源外泌体治疗卒中的作用机制还需要更加深入的探讨，以期更好地应用临床。