狼疮性肾炎患者外周血miR-1-5p 表达与Th17/Treg平衡的相关性及临床意义

韩志峰 岳璐玉 韩东

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种好发于青年女性、累及多脏器的自身免疫性疾病，其发病是一个多因素综合作用的结果，研究指出SLE 患者存在T 淋巴细胞减少、T 淋巴细胞功能下降、B 细胞过度增生，同时体内产生的大量自身抗体与相应自身抗原结合形成免疫复合物沉积在身体各个组织脏器，引起急慢性炎症及狼疮性肾炎（lupusnephritis，LN）等组织坏死［1-2］。LN 是指SLE 患者合并双肾免疫性损害，伴有一系列肾损害的临床表现如血尿、蛋白尿、肾功能不全等。LN 病情持续进展后可致终末期肾病出现，目前较多研究方向病情相似的LN 患者经规范化治疗后远期结局存在较大差异，推测存在某些影响病情走势的重要因素存在。miRNA 属于非编码小分子RNA，与机体的免疫调节密切相关，近年已在胃癌、肝癌等多种常见肿瘤组织中发现其异常表达［3-4］，且最新研究［5］指出miR-1-5p修饰的脐带间充质干细胞对SLE 的Treg 细胞具有免疫调节作用，而Treg 失衡已经被证实在SLE 及LN 的发生发展过程中发挥重要作用［6］，该研究结果提示miR-1-5p表达变化参与了SLE 及相关并发症的进展。本文以此为切入点探讨LN 患者中miR-1-5p的表达变化及其带来的后果，旨在为后续LN 患者的病情评估、预后不良风险分层、临床治疗方案制定等提供更多参考指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2021 年12 月至2022 年12 月间在山东国欣颐养集团枣庄中心医院接受治疗的SLE 患者170 例作为研究对象，其中86 例被诊断为LN 入LN 组，其余84 例入单纯SLE 组，均由患者本人签署知情同意书。纳入标准：①符合临床LN 诊断标准［7］；②LN 患者入组前3 个月内无免疫抑制剂、激素类药物服用史；③SLE 活动度评分＞4分［7］，疾病处于活动期；④资源入组、临床资料完整。排除标准：①合并严重肝功能异常、心功能异常；②合并恶性肿瘤性疾病；③确诊SLE 前以及存在其他肾脏疾病；④治疗依从性差或者治疗期间转院者；⑤妊娠或者哺乳期女性。LN 组、单纯SLE 组的基础资料具有可比性（P＜0.05）。见表1。本次研究经医院伦理委员会审核并批准。

表1 两组基础资料比较（）Table 1 Comparison of basic data between the two groups（）

表1 两组基础资料比较（）Table 1 Comparison of basic data between the two groups（）

1.2 外周血单个核细胞（PBMCs）miR-1-5p 表达量测定

入组患者治疗前留取2 mL 外周静脉血，与2 mL PBS 等体积混匀后加入淋巴细胞分离液，速度2 000 r/min、半径10 cm 离心2 min 后，吸管吸取中间白膜层至离心管、加入PBS 后吹打混匀，速度1 500 r/min、半径10 cm 离心7 min 后弃上清，再次加入PBS 吹打混匀，经速度1 000 r/min、半径10 cm 离心4 min 后弃上清。以U6作为内参设计引物序列如下：miR-1-5p上游引物5'-TCGAAGCTAGTGAGATGAGG-3'，下游引物5'-CATGATGAAGCTGAAGTGAGCC-3'；U6上游引物5'-AGCTGAACGTGAGCCGTGCGTAA-3'，下游引物5'-GTAGAAGTCGAAGCTTGATGA-3'。采用反转录试剂盒将miR-1-5p反转录为cDNA，采用在ABI 7500 型荧光定量PCR 仪进行实时荧光定量PCR 检测，扩增条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s、60℃复性60 s，共计45 个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-1-5p的相对表达量。

1.3 血清Th17/Treg 相关细胞因子水平检测

入组即刻（药物治疗前），留取所有患者的外周静脉血标本，分离血清后使用酶联免疫试剂盒测定其中Th17 细胞因子［白介素-17（interleukin-17，IL-17）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）］、Treg 细胞因子［转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）］的水平。

1.4 临床资料收集及预后评估

收集入组患者的临床资料，包括性别、年龄、体质指数、SLE 病程、活动性评分值。LN 患者进行随访及预后评估，随访终点为2023 年3 月1 日或者该日期前患者确诊不良预后的日期，随访途径为门诊定期复查、电话等。预后不良定义如下：患者病情进展至终末期肾病、肾小球滤过率下降＞50%、血清肌酐水平倍增、全因死亡。将所有患者分为预后不良组、预后良好组。

1.5 统计学方法

使用软件SPSS 22.0 对数据进行处理。计数资料以n（%）表示，两组间比较采用χ2检验；计量资料以（）表示，两组间比较采用t检验。外周血miR-1-5p表达量对LN 患者预后不良的预测价值分析采用受试者工作特征（ROC）曲线。以P＜0.05 为差异有统计学意义

2 结果

2.1 两组基础资料比较

LN 组、单纯SLE 组患者的性别、年龄、体质指数、SLE 病程、活动性评分值的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 两组外周血miR-1-5p 表达及Th17/Treg 相关因子水平比较

入院即刻，LN 组患者的外周血miR-1-5p表达水平低于单纯SLE 组；血清细胞因子IL-17、TNF-α水平高于单纯SLE 组患者，TGF-β、IL-10 水平低于单纯SLE 组患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组外周血miR-1-5p 表达及Th17/Treg 相关因子水平比较（）Table 2 Comparison of peripheral blood miR-1-5p expression and Th17/Treg related factor levels between the two groups（）

表2 两组外周血miR-1-5p 表达及Th17/Treg 相关因子水平比较（）Table 2 Comparison of peripheral blood miR-1-5p expression and Th17/Treg related factor levels between the two groups（）

2.3 LN 患者外周血miR-1-5p 表达量与Th17/Treg相关因子水平的相关性

Pearson 检验发现，LN 患者外周血miR-1-5p表达量与Tn17 相关细胞因子IL-17、TNF-α 水平呈负相关，相关系数r分别为-0.351、-0.374；与Treg 相关因子TGF-β、IL-10 水平呈正相关，相关系数分别为0.388、0.319（P＜0.05）。

2.4 不同预后LN 患者外周血miR-1-5p 表达及Th17/Treg 相关因子水平比较

86 例LN 患者随访期出现不良预后20 例并归于预后不良组，其余66 例归于预后良好组。预后不良组患者的外周血miR-1-5p表达水平低于预后良好组；血清细胞因子IL-17、TNF-α 水平高于预后良好组患者，TGF-β、IL-10 水平低于预后良好组患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 不同预后LN 患者外周血miR-1-5p 表达及Th17/Treg相关因子水平比较（）Table 3 Comparison of peripheral blood miR-1-5p expression and Th17/Treg related factor levels between LN patients with different prognosis（）

表3 不同预后LN 患者外周血miR-1-5p 表达及Th17/Treg相关因子水平比较（）Table 3 Comparison of peripheral blood miR-1-5p expression and Th17/Treg related factor levels between LN patients with different prognosis（）

2.5 LN 患者外周血miR-1-5p 表达量对治疗结局的预测价值

ROC 曲线显示，LN 患者外周血miR-1-5p表达量预测治疗预后不良的最佳截断值为1.025，AUC为0.780［95%CI：0.695～0.864］，灵敏度、特异度分别为74.14%、70.18%。见图1。

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

3 讨论

SLE、类风湿关节炎等自身免疫性疾病中发现存在多种miRNAs 的表达变化，且参与疾病进展。miR-1-5p最早被发现特异性表达于心肌细胞、骨骼肌细胞中，可通过靶向组蛋白去乙酰化酶4（histone deacetyase4，HDAC4）促进肌肉分化，且在胚胎干细胞、心肌细胞的发育中也有重要作用［8］。且较多研究［9-10］指出miR-1-5p在胆囊癌等恶性肿瘤组织中表达下调，通过靶向Notch2 抑制细胞增殖、迁移和侵袭。最新发现在类风湿性关节炎患者中存在miR-1 表达变化［11］，可用于患者的筛查。在对MRL/lpr 狼疮小鼠的研究［12］中发现，miR-1-5p 修饰的UC-MSCs 可能通过促进Treg细胞和Th2 细胞分化以减轻肾组织和肺组织损害。以上研究结论均提示miR-1-5p参与多种自身免疫性疾病的发生发展，且在本文中也显示LN组、单纯SLE 组中存在miR-1-5p的表达差异，具体表现为LN 组中miR-1-5p 表达量较低，提示低表达的miR-1-5p可能参与SLE 患者的肾功能损害进展。

Th17/Treg 细胞均为T 细胞的辅助细胞，通过分泌细胞因子的形式参与炎症反应过程。Th17 及其分泌的细胞因子主要发挥促炎作用，而Treg 及其分泌的细胞因子主要通过抑制Th17 反应来调节免疫平衡［13］。Th17/Treg 平衡的维持对机体内环境稳态非常重要，LN 发病时存在Th17 细胞过度分化并导致一系列促炎细胞因子分泌；Treg 被抑制，引起Th17/Treg 轴失衡，且病理状态下Treg具有效应CD4+T 细胞的特征，在接受外部信号后分化为产生IL-17 等促炎因子的Th17 样细胞，进一步加剧炎症反应［14］。既往研究［15］也指出糖皮质激素、免疫抑制剂等治疗方案主要通过改善LN 患者外周血Th17/Treg 比值来缓解病情，且Th17/Treg有可能作为预测LN 患者治疗反应的敏感性指标。鉴于Th17/Treg 失衡在LN 发生发展过程中扮演的关键性角色，某些影响Th17/Treg 轴功能的关键分子可能左右疾病进展速度及治疗结局。

为明确miR-1-5p是否通过影响Th17/Treg 轴平衡而参与LN 进展，文中进一步经相关性分析证实，LN 患者中miR-1-5p表达量与Th17 分泌的细胞因子水平呈负相关，与Treg 分泌的细胞因子水平呈正相关，推测miR-1-5p可能具有抑制Th17、增强Treg 的功能，而miR-1-5p表达抑制可能通过该途径参与SLE、LN 的进展。关于miR-1-5p具体作用于何种分子、调控何种信号通路而产生对Th17/Treg 轴平衡的影响，目前尚不明了、是下一步需要深入研究的内容。

LN患者在入院后早期已经存在外周血miR-1-5p的明显表达变化，是否对远期随访预后存在早期预警价值。文中用ROC 曲线结果明确了该猜想，结果发现当外周血miR-1-5p表达量＜1.025 时，远期预后不良的风险较高，预测的灵敏度、特异度达74.14%、70.18%。提示在LN 患者入院后早期可将外周血miR-1-5p表达量作为常规检查项目，若发现其存在异常低表达应高度警惕远期预后不良风险，及时完善其他检查项目并制定针对性治疗方案、尽可能优化治疗结局。

综上所述，可得出结论：LN 患者存在外周血miR-1-5p异常低表达，且与Th17、Treg 相关细胞因子水平存在紧密关联，对患者远期的治疗预后也有一定预警价值。检测外周血miR-1-5p表达量可能有益于LN 患者的筛查、病情评估、治疗结局预测等，是一个简便可靠的全新miRNA 指标。