雾水葛总黄酮涂膜剂的制备及抗氧化研究

吴冬凡,丁 莹

(广东药科大学 广东省化妆品工程技术研究中心,广东 广州 510006)

雾水葛Pouolia seylanic (L.) Benn.为荨麻科雾水葛属植物,是我国南方地区一种常用的民间草药。雾水葛以全草入药,有消肿祛脓、清热解毒、利水通淋的功效,主要用于急性乳腺炎以及各种化脓性皮肤感染的治疗。目前研究发现其活性成分主要有黄酮类[1]、木脂素类[2]、挥发性成分[3]、生物碱[4]等。现代研究表明,雾水葛具有抗炎镇痛[5]、抗皮肤溃疡[6]、抗菌[7]、抗氧化[8]、抗肿瘤[9]、降血糖[10]等作用。

黄酮类化合物有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁、降血压、降血糖等药理作用。陈卓翰[11]采用金黄色葡萄球菌诱导小鼠皮下脓肿模型评价总黄酮提取物对化脓性皮肤细菌感染的疗效。实验结果表明,总黄酮提取物能抑制皮下脓肿的增长,促进伤口愈合,是该植物的活性部位。因此本课题选取雾水葛总黄酮作为原料,利用正交试验探讨其涂膜剂的最佳制备工艺。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 实验材料 雾水葛药材采摘自中山市广东药科大学中山校区,经广东药科大学田素英老师鉴定为荨麻科雾水葛属雾水葛Pouzolziazeylanica(L.) Benn.的全草。白及药材购于中山市中智中药饮片有限公司。所用菌种为绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(由中国药品生物制品检定所提供)。

1.1.2 实验试剂 芦丁标准品(成都埃法生物科技有限公司,批号:153.18.4),DPPH(上海如吉生物科技发展有限公司,批号:1898-66-4),其余试剂均为分析纯。

1.1.3 实验仪器 721型分光光度计(株式会社日立制作所,U-3900),电子天平(上海恒平科学仪器有限公司,JA2003),多功能高速中药粉碎机(温州顶历医疗器械有限公司,DFT-150)。

1.2 实验方法

1.2.1 雾水葛总黄酮的提取与大孔树脂纯化 取300g粗粉,以10倍量石油醚回流1h,过滤后再用8倍量石油醚回流1h,滤液经纱布过滤后以8倍量的70%乙醇回流3次,每次1h,合并乙醇滤液,用旋转蒸发仪减压浓缩至100mL,离心,取上清液,再加蒸馏水配置成0.3g生药/mL的溶液,调节溶液pH=5,然后先往AB-8大孔树脂柱加入150mL的提取液,控制好流速为60mL/h,过柱后用60mL蒸馏水洗除去杂质,再用60mL 60%乙醇洗脱,收集60%乙醇提取液[12]。

1.2.2 PVA-124预处理和白及胶浆制备 称取PVA-124,用适量85%的乙醇浸泡过夜,滤过,重复3次以上,烘干备用;取适量白及,粉碎,加10倍量蒸馏水浸泡至少2天,温度控制在4℃左右,不定期搅拌,用纱布滤过,滤液加乙醇,调节含醇量为70%～80%,静置过夜,单层纱布过滤,将得到的絮状沉淀物干燥,即得白及胶。然后称取适量的白及干胶加10倍量的蒸馏水,水浴加热并搅拌使其充分溶解,得白及胶浆备用[13]。

1.2.3 单因素考察 为优选雾水葛涂膜剂的最佳制备工艺,在查阅了涂膜剂的相关文献的基础上,进行单因素试验,主要考察成膜材料PVA-124和白及胶浆,增塑剂甘油,乳化剂吐温-80,增强剂可溶性淀粉五个因素对涂膜剂成膜性能的影响,以成膜时间和外观质量为指标,做出雾水葛涂膜剂成膜时间和外观质量随各个因素用量变化的图表,观察其变化趋势,以进一步缩小各成分的用量范围[14],为下一步正交试验提供合适数据。

(1)各因素的考察。固定处方中的白及胶浆、甘油、吐温-80、可溶性淀粉的用量,然后分别加入5.0g、5.5g、6.0g、6.5g、7.0g、7.5g PVA-124以及2g总黄酮提取物于50mL蒸馏水中,在80～90℃下加热并搅拌20min,静置至无气泡,即得雾水葛涂膜剂。

固定处方中的PVA-124、甘油、吐温-80、可溶性淀粉的用量,分别加入2g、3g、4g、5g、6g、7g白及胶浆以及2g总黄酮提取物于50mL蒸馏水,在80～90℃下加热并搅拌20min,静置至无气泡,即得雾水葛涂膜剂。

固定处方中的PVA-124、白及胶浆、吐温-80、可溶性淀粉的用量,分别加入0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g甘油以及2g总黄酮提取物于50mL蒸馏水,在80～90℃下加热并搅拌20min,静置至无气泡,即得雾水葛涂膜剂。

固定处方中的PVA-124、白及胶浆、甘油、可溶性淀粉的用量,分别加入0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g、1.2g吐温-80以及2g总黄酮提取物于50mL蒸馏水,在80～90℃下加热并搅拌20min,静置至无气泡,即得雾水葛涂膜剂。

固定处方中的PVA-124、白及胶浆、甘油、吐温-80的用量,然后分别加入0g、0.25g、0.50g、0.75g、1.00g、1.25g可溶性淀粉以及2g总黄酮提取物于50mL蒸馏水,在80～90℃下加热并搅拌20min,静置至无气泡,即得雾水葛涂膜剂。

(2)评分标准。总分=外观质量+(15-成膜时间)。外观质量:分散度2.5分;透明度2.5分;韧性2.5分;可揭布性2.5分。成膜时间:取涂膜剂适量均匀涂于玻璃板上,置于32℃的烘箱中,以min为单位,观察并记录成膜时间[15]。

1.2.4 正交试验设计 根据PVA-124(A)、白及胶浆(B)、甘油(C)、吐温-80(D)和可溶性淀粉(E)的单因素试验结果,以涂膜剂的成膜时间和外观质量为考察指标,,进行L16(45)正交试验,因素和水平如表1所示。

表1 L16(45)正交试验因素水平 (g)

总分=外观质量+(10-成膜时间)

外观质量:分散度2.5分;透明度2.5分;韧性2.5分;可揭布性2.5分。

成膜时间:取涂膜剂适量均匀涂于玻璃板上,置于32℃的烘箱中,以分钟为单位,观察并记录成膜时间。

1.2.5 实验操作 按上述正交试验优选出来的配比制备三批雾水葛涂膜剂,测定三批样品的成膜时间以及外观质量,进行评分。

1.2.6 雾水葛总黄酮涂膜剂的抑菌作用考察 (1)培养基的制备。按照琼脂培养基和营养肉汤培养基的说明书,按比例准确称取固体琼脂粉和固体营养肉汤粉末于锥形瓶中并加入蒸馏水至250mL,用牛皮纸进行封口,并用立式压力蒸汽灭菌器在121℃下灭菌20min,取出后降温至合适温度即可将琼脂培养基在超净工作台上进行倒平板操作,冷却后倒置平板,并用紫外线灭菌。

(2)菌种的活化与菌液的制备。在超干净工作台上点燃酒精灯,然后将接种环灼烧冷却后蘸取绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌种,分别在已经制备好的琼脂培养基上进行平板划线操作。划线完成后将各菌种在最适温度下进行培养24h。取出培养基后用接种环挑取有活力的菌落再次重复上述操作,活化两次,然后在超净工作台用接种环挑取有活力的菌落里接入新鲜配制的营养肉汤中,用摇床进行培养24h[16]。将营养肉汤通过连续稀释平板计数法,稀释成108CFU。

(3)抑菌活性的测定。用打孔器将滤纸片打出多个小圆片并进行灭菌处理,将其浸泡在50mg/mL总黄酮浓度的样品溶液和100mg/mL总黄酮浓度的样品溶液中,同时设置空白组和阳性对照组;取0.1mL稀释到108CFU/mL的三种菌液,用移液枪注入培养基中,用涂布棒进行均匀涂布(每次涂布前都需将涂布棒灼烧灭菌并冷却)[17]。将培养基分成四个部分,做好标记,将样品组、空白组和阳性对照组小圆片按标记放贴在各个区域的中心,用镊子轻轻按压小圆片。封口后,放入恒温培养箱,于各菌种最佳培养温度培养1个生长周期。待培养基上长出菌落后,测量抑菌圈直径[18]。重复实验多次,结果以(均值±标准差)的形式表示。

1.2.7 雾水葛总黄酮涂膜剂的抗氧化作用考察 (1)DPPH自由基清除率的测定。DPPH自由基可以溶解在乙醇中,形成紫色的溶液,在517nm处有特征吸收。加入黄酮类化合物时,黄酮苯环上的酚羟基的H原子将与DPPH自由基的未成对电子配对[19],溶液颜色变为黄色。所以通过517nm处吸光度的变化,就可以黄酮对DPPH 自由基的清除效率。

配制以下溶液:3×10-4mol/L的DPPH-无水乙醇溶液;0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的样品溶液;0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的Vc溶液。

取样品溶液2mL和DPPH-无水乙醇溶液2mL,摇匀,静置0.5h。无水乙醇调零,在517nm测定吸光度,记为A0;取样品溶液2mL和无水乙醇2mL,摇匀,静置0.5h。无水乙醇调零,在517nm测定吸光度,记为A1;取无水乙醇2mL和DPPH-无水乙醇溶液2mL,摇匀,静置0.5h。无水乙醇调零,在517nm测定吸光度,记为A2。

以Vc溶液为阳性对照;根据公式1计算DPPH自由基的清除率。

(公式1)

(2)还原能力的测定。配制以下溶液:0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的样品溶液;0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的Vc溶液。

分别将各浓度样品溶液2mL、1% K3[Fe(CN)6]溶液2mL、pH=6.5的磷酸盐缓冲液2mL加10mL试管中,蒸馏水定容,摇匀,在50℃下反应0.5h,反应之后与2mL10%三氯乙酸混匀,静置10min,5 000r/min高速离心5min,取上清液2mL,加入2mL蒸馏水、0.5mL0.1% FeCl3溶液,摇匀,反应10min,测定700nm下的吸光度,记为A1;以2mL蒸馏水代替样品溶液重复上述实验,吸光度记为A0;样品+缓冲液+蒸馏水(加入量=铁氰化钾+三氯乙酸+蒸馏水+三氯化铁的总量),重复上述实验,吸光度记为Aj;以Vc为阳性对照品,比较Vc和样品的还原能力[20]。

2 结果与分析

2.1 单因素结果

2.1.1 PVA-124的影响 从表2可知,随着PVA-124用量的增加,成膜时间呈现变大的趋势,外观质量也在下降,这是因为过大质量分数的PVA-124已经出现饱和,浓稠的混合物阻碍水分的挥发,致使成膜时间越来越长;配成的溶液也随着质量分数的变大越来越浑浊,形成的膜也含有许多未溶解的物质。综上所述,选择5.0g、5.5g、6.0g、6.5g的PVA-124进行正交试验。

表2 不同用量PVA-124制得的雾水葛总黄酮涂膜剂的参数

2.1.2 白及胶浆的影响 从表3可知,随着白及胶浆用量的增加,成膜时间呈现变大的趋势,外观质量也在下降,这是因为过大质量分数的白及胶浆已经出现饱和,浓稠的混合物阻碍水分的挥发,致使成膜时间越来越长;配成的溶液也随着质量分数的变大越来越浑浊,形成的膜也同样含有许多未溶解的物质。综上所述,选择2.0g、3.0g、4.0g、5.0g的白及胶浆进行正交试验。

表3 不同用量白及胶浆制得的雾水葛总黄酮涂膜剂的参数

2.1.3 增塑剂甘油的影响 从表4可知,从成膜时间上看,随着甘油质量分数的增加,各个处方制成的雾水葛涂膜剂的成膜时间呈现先减少后增加的趋势,可见甘油的质量分数对涂膜剂成膜时间有一定影响。甘油质量分数大于5.0%时,膜十分柔软,甚至有少量甘油析出,外观质量下降;当甘油质量分数小于2.0%时,膜薄、易撕开,原因可能是甘油质量分数小,不能很好地增加膜的塑形。综上所述,选择1.0g、1.5g、2.0g、2.5g的甘油进行正交试验。

表4 不同用量甘油制得的雾水葛总黄酮涂膜剂的参数

2.1.4 乳化剂吐温-80的影响 从表5可知,从成膜时间上看,各个处方制成的雾水葛涂膜剂的成膜时间无明显规律,但有变化,可见吐温-80的质量分数对涂膜剂成膜时间有一定影响。吐温-80质量分数大于2.0%时,膜表面有较多颗粒析出,外观质量下降;当甘油质量分数小于0.8%时,膜薄,水溶性不好,原因可能是吐温-80质量分数小,不能很好地降低表面张力,使其更易溶于水。综上所述,选择0.4g、0.6g、0.8g、1.0g的吐温-80进行正交试验。

表5 不同用量吐温-80制得的雾水葛总黄酮涂膜剂的参数

2.1.5 增强剂可溶性淀粉的影响 从表6可知,从成膜时间上看,各个处方制成的雾水葛涂膜剂的成膜时间无明显规律,但有变化,可见可溶性淀粉的质量分数对涂膜剂成膜时间有一定影响。可溶性淀粉质量分数大于2.0%时,膜的表面有大量小颗粒析出,外观质量下降;而且由于可溶性淀粉的增强效果,使得薄膜与玻璃板之间的黏着力增大,不易揭开。可溶性淀粉质量分数小于0.5%时,形成的膜较薄,易撕开。综上所述,选择0.25g、0.50g、0.75g、1.00g的可溶性淀粉进行正交试验。

表6 不同用量可溶性淀粉制得的雾水葛总黄酮涂膜剂的参数

2.2 正交试验结果

结果见表7和表8。

表7 正交设计表及试验结果

表8 以综合评分为指标的方差分析

从成膜时间为指标的极差看出,5个因素对成膜时间的影响A>E>C=D>B;从外观质量为指标的极差看出,5个因素对外观质量的影响A>B>D=E>C;从综合评分为指标的极差看出,5个因素对综合评分的影响A>B>E>C>D;从综合评分的极差可以看出,吐温-80由于用量小,对膜的性能影响不大。

从表8可见,PVA-124的用量对涂膜剂成膜性能的影响有显著性差异,而白及胶浆、甘油、吐温-80和可溶性淀粉的用量对涂膜剂成膜性能的影响没有显著性差异。根据直观分析表和方差分析表的结果得出,雾水葛涂膜剂最佳工艺处方是A1B3C2D3E3,即PVA-124 5.0g、白及胶浆4g、甘油1.5g和吐温-80 0.8g以及0.75g可溶性淀粉。

按照正交试验结果优化配比A1B3C2D3E3,即PVA-124 5.0g、白及胶浆4g、甘油1.5g和吐温-80 0.8g以及0.75g可溶性淀粉,制成三批涂膜剂,进行成膜时间、外观质量和综合评分的测定,结果如表9。

表9 制备工艺的验证实验

结果显示平均成膜时间4.3min,外观质量8.8分,综合评分14.5分,这说明制备后的处方工艺可靠,重复性较好。

2.3 水葛涂膜剂的抑菌考察结果

结果如下表10。

表10 不同总黄酮浓度雾水葛涂膜剂对三种细菌的抑菌圈

50mg/mL和100mg/mL总黄酮浓度的雾水葛涂膜剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的抑菌圈直径与阳性对照组对比P≤0.05且P≤0.01,说明50mg/mL和100mg/mL总黄酮浓度的雾水葛涂膜剂对三种菌的抑菌圈直径与阳性对照组均有极显著性差异。

2.4 雾水葛涂膜剂的抗氧化考察结果

结果如下表11和表12。

表11 不同总黄酮浓度雾水葛涂膜剂和Vc对DPPH自由基的清除率

表12 不同总黄酮浓度雾水葛涂膜剂和Vc的还原能力

通过预实验,见图1,得出雾水葛总黄酮涂膜剂对DPPH自由基的清除率的总黄酮浓度合适范围是0.05～0.8mg/mL。在总黄酮浓度0.05～0.8mg/mL内,雾水葛涂膜剂和Vc对DPPH自由基清除率均呈现逐渐上升的趋势并最终达到了稳定值。在总黄酮浓度0.05～0.2mg/mL内,雾水葛涂膜剂对DPPH自由基的清除率低于Vc组;总黄酮浓度0.2～0.8mg/mL内,雾水葛涂膜剂对DPPH自由基的清除率高于Vc组。雾水葛涂膜剂的DPPH自由基清除率最高值超过了Vc组,说明雾水葛涂膜剂有良好的清除DPPH自由基的能力。在实验浓度范围内,见图2,随着总黄酮浓度的增加,雾水葛涂膜剂和Vc的清除率值均呈现上升趋的势,且雾水葛涂膜剂的清除率值均大于Vc组。这说明雾水葛涂膜剂有良好的还原能力。

图1 不同总黄酮浓度雾水葛涂膜剂和Vc对DPPH自由基的清除率

图2 不同总黄酮浓度雾水葛涂膜剂和Vc的还原能力

3 讨论

雾水葛在民间有广泛的应用,大量的文献证明雾水葛有良好的抗炎镇痛作用,可消肿祛脓、清热解毒、利水通淋,主要用于急性乳腺炎以及各种化脓性皮肤感染的治疗。本实验通过以雾水葛总黄酮为原料制备的涂膜剂,进行对化脓性感染常见的绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌实验,初步探讨其抑菌的活性成分。实验结果表明,雾水葛总黄酮涂膜剂对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的有一定抑菌效果,具有一定的抗炎祛痘功效。涂膜剂使用方便,毋须进行包扎,容易进行清洗,制备工艺也较为简单,适合对大众的普及,未来应加强对其质量标准的研究。