IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132在类风湿性关节炎患者中的表达及临床意义

许春娇

（江西省赣州市会昌县人民医院，江西 赣州 342600）

类风湿性关节炎是一种自身性免疫疾病，以侵蚀全身关节为主要特征，病理基础主要为滑膜炎，疾病发作初期关节表现为晨僵、肿胀、疼痛，疾病发作终末期可发生关节畸形，并导致丧失关节正常功能[1]。类风湿性关节炎在全球的患病率为0.2%～1%，在我国的患病率为0.28%～0.41%，患病人群近500万，男女患病比例为1：4，其中80%为女性患者，可发生于任何年龄阶段[2]。类风湿性关节炎的病因至今尚未完全阐明，可能与自身免疫、遗传、吸烟、微生物感染有关[3]。我国大部分患者对类风湿性关节炎的认知水平较低，且基层地区缺乏有效诊治方法，加之类风湿性关节炎症状不典型，常与骨性关节炎、滑膜腱鞘炎等混淆，导致临床诊断延误，治疗不当等情况[4]。因此，寻找有效的治疗靶点是临工作者迫切需要解决的问题。类风湿性关节炎为慢性炎症疾病，细胞因子分泌异常影响类风湿性关节炎，白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）会参与到免疫反应、炎性反应、免疫损伤中，对类风湿性关节炎会产生影响。血清可溶程序性死亡分子-1（soluble PD-1，sPD-1）为协同刺激分子，血液循环和免疫应答会受到影响，在判断自身免疫性疾病中参考价值高[5]。正五聚素蛋白-3（ortho pentameric protein-3，PTX3）与免疫疾病的发生相关，在类风湿性关节炎疾病中呈高表达状态。微小核糖核酸-132（microRNA-132，miR-132）会影响免疫细胞成熟阶段和稳定维持，与该疾病的发生关系密切。通过对相关指标分析，评估类风湿性关节炎的情况，判断严重程度，为疾病的诊治提供相应的依据，有助于改善患者预后[6]。本研究旨在分析类风湿性关节炎患者IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132的表达意义。

1 对象与方法

1.1 一般资料 研究起止时间2022年12月至2023年12月。A组100例：男56例，女44例；年龄30～72岁，平均（47.52±5.36）岁。B组50例：男26例，女24例；年龄33～71岁，平均（47.25±5.43）岁。对照组50例：男27例，女23例；年龄36～70岁，平均（47.28±5.41）岁。组间一般资料对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入标准：A组经过相关检查确诊类风湿关节炎；所选对象和家属知情研究内容；配合程度高。排除标准：精神类疾病；感染及恶性肿瘤；严重心、肝、肾等脏器疾病。全部研究对象均知情并同意且签署知情同意书。我院伦理委员会已批准本研究。

1.2 方法 采集静脉血5 mL，以3 000 r/min的速度离心10 min，取上清液检测。①IL-8检测：采用上海纪宁IL-6检测试剂盒（酶联免疫法）检测，将试剂盒取出后放置到室温，设置待测标本和阴性对照组及标准品，洗板3次加入100 μL酶标志物，在37 ℃温育1 h后甩弃液体，再加入洗涤液，静置30 s后甩弃液体，重复5次，拍干，加入显色剂A和显色剂B各50 μL，混匀后在37 ℃避光显色10 min，加入终止液50 μL，混匀后在450 nm下测定各孔吸光度数值。②sPD-1检测：采用九邦生物人sPD-1 elisa检测试剂盒检测sPD-1，将试剂盒取出后平衡到室温，取出板条带，设置标准品孔、样品孔，标准品孔各加入不同浓度的标准品50 μL；待测样品孔先加待测样品10 μL，再加样品稀释液40 μL，随后标准品孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，再用封板膜封住反应孔，放置37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min，弃去液体，吸水纸上拍干，再每孔加满洗涤液，静置1 min，甩弃洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗板5次，每孔各加入底物A和底物B50 μL，放置37 ℃避光孵育15 min，每孔各加入终止液50 μL，温育15 min内，在酶标分析仪450 nm波长处测定各孔吸光度值。③PTX3检测：采用莼试生物人五聚素3酶联免疫吸附试剂盒检测PTX3，将试剂盒取出后平衡放置到室温，拿出板条，设置空白孔和标准孔及待测样品孔，在酶标包被上的标准品准确加样50μL、待测样品孔加入样品稀释液40 μL，再加入待测样品10 μL，加样将样品加于酶标板孔底部，轻晃摇匀，用封板膜封住反应孔，放入37 ℃水浴锅或恒温箱温育30 min，将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍后备用，撕去封板膜，弃掉液体，甩干，每个孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次后拍干，每孔加入显示剂A和显示剂B各50 μL，放置37 ℃避光孵育15 min，每孔加入终止液各50 μL，温育时间15 min内，在酶标分析仪450 nm波长处测定各孔吸光度值。④miR-132检测：采用Trizol reagent RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司）对血清样品总RNA进行提取，采用7500型荧光定量聚合酶链式反应仪（美国ABI公司）应用实时聚合酶链式反应法对血清miR-132相对表达量进行检测，以U6为内参，RNA催化合成采用cDNA：PrimerScriptTM RT试剂盒，RNA扩增采用SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR试剂盒，miR-132正向引物：5'ACGTCGTGTAGCTTATAAGACTG3'，反向引物：5'ACTGCTTGTTCTACACACTCTG3'，反应条件为95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s 变性，58 ℃ 30 s 退火，72 ℃ 30 s延伸，来回进行40个循环，每个标本重复做3个孔位。反应完成后进行溶解曲线分析（15 s 95 ℃，1 min 60 ℃，15 s 95 ℃，15 s 60 ℃），每个反应体系中荧光信号达到所设定阈值所经历的循环数即为Ct值，以U6为内B组，采用2-ΔΔCt法计算PBMC中miRNA的相对表达水平其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6，ΔΔCt=ΔCt实验组标本-ΔCt对照组标本。

1.3 观察指标 比较IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132。比较A组活动期、缓解期IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132。比较轻度、中度、重度患者IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132。

1.4 统计学方法 数据由SPSS 20.0软件分析，计量资料采用表述，组间比较行t检验；计数资料采用n（%）表述，组间比较行χ2检验；P＜0.05则表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清学指标 A组IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132高于B组、对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 3组血清学指标比较（）

表1 3组血清学指标比较（）

2.2 A组血清学指标 活动期IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132高于缓解期（P＜0.05）。见表2。

表2 A组血清学指标比较（）

表2 A组血清学指标比较（）

2.3 轻度、中度、重度患者的血清学指标 轻度、中度、重度患者IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 轻度和中度及重度患者的血清学指标比较（）

表3 轻度和中度及重度患者的血清学指标比较（）

3 讨论

类风湿性关节炎是临床常见的自身免疫疾病，在全球范围内的发病率为0.2%～1.0%，在我国的患病率为0.28%～0.41%，近年来有持续增加的趋势，可发生在任何年龄阶段[7]。侵蚀性关节炎为类风湿性关节炎的发病特点，滑膜炎为基础，症状表现肿胀、疼痛、关节畸形等，出现不同程度功能障碍，还会出现关节炎症和全身炎性反应等严重情况，显著降低身体健康水平和生活质量，对患者的负面伤害非常明显[8]。类风湿性关节炎发生原因尚不清晰，与多诸多因素相关，包括免疫功能、遗传、吸烟、感染等，对症治疗为基本原则，大部分患者无法根治，为此要寻找更为有效的靶点进行治疗，以提升疗效[9]。

类风湿性关节炎是关节进展损伤，功能障碍比较明显，复发多变，在发病过程中，多细胞因子都会参与，对T、B细胞活化、分化会产生影响，生成抗体，对免疫功能会产生严重影响，导致类风湿性关节炎的发生和进展[10]。IL-8是前炎性细胞因子一种，参与类风湿性关节炎免疫反应、炎性反应、免疫损伤，对T细胞能产生诱导作用，增加炎性因子的生成，同时可对IL-12产生影响，激活中性粒细胞，导致类风湿性关节炎[11]。对类风湿性关节炎患者来说，IL-8升高比较明显，其水平升高说明致残率提升，炎性反应的发生风险也会增加。IL-8是常见趋化因子，IL-8和重组蛋白受到细胞外调节蛋白激酶的影响，转导分子调控类风湿性关节炎中成纤维样滑膜细胞，会导致类风湿性关节炎出现[12]。sPD-1是血清可溶性PD-1，CD28一员，在免疫性疾病发生与发展中发挥着关键的作用，继而参与到血液循环、免疫表达中。2号染色体的sPD-1基因会出现变化，对感染、肿瘤、免疫病等影响非常明显。sPD-1是协同刺激分子，在机体内的正常表达非常少，不参与到血液循环中，且对免疫应答有调节能力，实现纠正免疫失衡的目的。sPD-1对促炎症T细胞反应能产生抑制，减轻免疫疾病对机体损伤，而类风湿性关节炎患者sPD-1水平比较高，与晨僵时间关系比较密切，与类风湿性关节炎发病也有关，类风湿性关节炎患者，sPD-1为高水平，为正相关[13]。PTX3是正五聚素蛋白-3，与免疫性疾病的出现、发展关系密切，来源平滑肌细胞、天然免疫细胞，是肿瘤坏死因子刺激基因，对IL-1、TNF-α的信号会产生影响。PTX3会受到干扰素-γ、IL-10的影响，干扰素-γ对树突状细胞、单核细胞等PTX3产生影响，IL-10能提升脂多糖依赖性表达能力。PTX3是对炎症过程能产生调节，对免疫、血管完整性、自身免疫等都会产生影响。PTX3有助于清除凋亡细胞，对自身抗原进行调节，对细胞因子、先天性抵抗力会产生影响。骨性关节炎和类风湿性关节炎患者中PTX3表达水平提升明显，故PTX3是比较理想的诊断标志物[14]。miR-132在免疫细胞成熟的各环节发挥作用，维持和调节免疫稳态，与免疫性疾病之间关系密切，在免疫细胞成熟多环节和免疫维持影响比较明显。miRNA会对蛋白α调控巨噬细胞起到影响作用，增强细胞浸润、吞噬的能力，加速促炎细胞因子分泌，使更多细胞因子参与到类风湿性关节炎的发生及发展过程中。miR-132是长度22bp的小分子RNA，影响类风湿关节炎的易感性。骨性关节炎患者的miR-132和健康人群差异较大，miR-132在类风湿性关节炎为高表达，参与到类风湿性关节炎的发生发展中，是诊断类风湿性关节炎的主要参考指标[15]。

综上所述，类风湿性关节炎患者检测IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132的意义明确，对其分析能判断疾病的情况，确定严重程度，结合相关信息制订治疗方案。