大鼠自由落体创伤性脑损伤动物模型的建立

杨家发 朱义通 陆兆丰△ 王亚琼 陆若玉 李海荣 刘梦佳

1)河南科技大学第一附属医院(河南科技大学临床医学院)开元院区急诊科 洛阳 471003 ;2)上海交通大学公共卫生学院上海 200001

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是死亡和残疾的主要原因之一,是一个国际公共卫生问题[1]。为了深入了解脑外伤的机理,研究人员已经建立了一些实验动物模型,如大鼠自由落体(weight-drop)引起的脑外伤,模拟人类闭合损伤。Western blot分析显示,与对照大鼠相比,所有炎症表达标志物在撞击后第1天和第7天均有所增加。神经功能障碍的严重程度和炎症标志物的诱导与分级的机械冲击水平密切相关。自由落体诱导的创伤性脑损伤模型可以产生分级脑损伤和诱发神经行为缺陷,并可能与开发创伤性脑损伤的治疗策略有转化相关性[2]。TBI导致血脑屏障功能障碍,两个关键生物过程的破坏引发血脑屏障功能障碍。第一个过程涉及由紧密连接(TJ)蛋白丢失表明的细胞旁运输增加,允许通常被限制的中性粒细胞等免疫细胞的分子通过,加剧炎症反应。第二个过程是由于通过内皮细胞(endothelial cells,EC)胞吞作用的增加,导致转运通常被限制进入大脑的大分子和血清蛋白(如白蛋白)[3]。血脑屏障的测量对研究血脑屏障功能障碍或破坏与脑障碍发病机制间的相互作用具有重要意义。应采用适当的方法研究血脑屏障的完整性。示踪剂、血浆蛋白、紧密连接蛋白和成像模式可用于检测血脑屏障的通透性[4]。本研究拟建立自由落体创伤性脑损伤动物模型,通过神经行为学、病理形态学、组织病理学、蛋白免疫学评价动物模型,以期为后续的颅脑损伤研究提供参考。

1 材料与方法

1.1动物选择40只4月龄无特定病原级雄性 Sprague Dawley 大鼠,购自普莱柯生物工程股份有限公司,动物许可证号:SYXK(豫)2016-0023。体质量(320.17 ± 15.46) g (范围:215.5～335.4 g)。饲养于 12 h /12 h 明暗交替环境,温度保持在25 ℃,术前12 h禁食,6 h禁水[2]。

1.2主要试剂和仪器β-APP及GFAP免疫组化试剂盒购自美国Sigma公司,4%多聚甲醛购自上海碧云天生物技术有限公司,注射用盐酸替来他明盐酸唑拉西泮(苏泰®50)购自法国维克有限公司,脑立体定向仪购自深圳瑞沃德医疗器械有限公司,环钻购自江苏塞德医疗器械有限公司,24G针管回缩式静脉留置针购自山东威海锐捷医用制品有限公司。

1.3实验方法

1.3.1 动物分组 将大鼠按体质量随机分为假手术组和轻度、中度、重度创伤性脑损伤组,每组 10只。

1.3.2 大鼠创伤性脑损伤动物模型[2]实验用苏泰(50 mg/kg)腹腔注射后俯卧于脑立体定位仪上,颈部垫圆柱形海绵垫抬升头部确保顶骨充分暴露。固定后额顶部剃毛、消毒、铺巾。正中切开,剥离骨膜,暴露右顶骨。用环钻在冠状缝后1.5 mm、中线旁 2.5 mm处钻一直径7 mm骨窗,保持硬脑膜完整。将内径6 mm 4.5 g钢棒分别从内径7 mm聚氯乙烯透明管高度50 cm、75 cm、100 cm自由下落,撞击硬脑膜致右顶叶轻、中、重度脑挫裂伤。骨蜡封闭骨窗,缝合头皮。假手术组开窗后用骨蜡封闭,不施加打击。

1.3.3 大鼠神经功能评分 采用改良神经损伤评分(modified neurological severity scores,mNSS)量表对各组大鼠在伤后第1、3、7 天进行神经行为学损害程度评分。

1.3.4 HE染色及免疫组织化学染色 伤后24 h,腹腔注射苏泰麻醉,纤维放大镜下用24 G针管回缩式静脉留置股静脉穿刺。术后1h在麻醉状态下暴露胸腔,剪开心包,在左心室剪开小口,插入灌流针并固定[2]。夹闭下腔动静脉及腹主动脉,右心耳剪开小口,左心室灌注0.9%NaCL注射液,直至右心耳流出液清亮为止,以清除血中染料。缓慢灌注4%多聚甲醛,断头取脑迅速浸入10%甲醛150 mL固定1 h,石蜡包埋,5 μm 冠状切片,作HE染色及免疫组化染色[2]。

2 结果

2.1神经行为学改变轻、中、重度组大鼠伤后第 1、3、7 天 的 mNSS 评分均高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表 1。

2.2脑组织病理学检查大体标本观察:假手术组组织完整,切缘无损伤区;随着打击重量或高度增加,损伤区水肿、出血、渗出明显增加,脑疝逐渐加重。HE染色:假手术组的神经元及神经胶质细胞均正常。随损伤加重,损伤区结构紊乱,细胞及细胞骨架形态缺失,损伤区边缘水肿逐渐加重(图 1)。

2.3免疫组织化学染色结果假手术组大脑皮质无明显β-APP、GFAP表达,其余各组均可见β-APP、GFAP在神经元浆膜下和(或)轴突处积累,免疫组织化学染色呈棕染。随致伤量的增加,其阳性染色体神经元细胞数增加和表达强度增强。损伤后24 h,轻度、中度、重度组大脑皮质β-APP 和GFAP表达程度逐渐增强[6](图 2)。

图1 创伤性脑损伤24 h后脑组织病理学(HE×400)A:假手术组;B:轻度组;C:中度组;D:重度组

图2 创伤性脑损伤24 h后脑组织免疫组化染色 A～C 示β-APP染色,E～H示GFAP染色其中,A、E示假手术组,B、F示轻度组,C、G示中度组,D、H示重度组

表1 4组大鼠术后mNSS评分比较

3 讨论

TBI是造成死亡、残疾和精神健康障碍的主要原因之一。大多数TBI患者患有长期创伤后应激、认知功能障碍和残疾。这种神经病理进展的潜在分子和细胞机制仍不清楚。动物模型能反映不同类型的人类脑损伤。局灶性损伤是一种局域性损伤,在控制性皮层损伤、弹道穿透性脑损伤和Feeney自由落体损伤等动物模型中均有所体现[5]。大鼠自由落体损伤模型模拟了人类创伤性脑损伤引起的弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)。TBI对脑实质施加强大的旋转力和平移力,导致DAI而引发脑细胞肿胀和神经元死亡。TBI后,轴突退变是一个进行性过程,开始于轴突运输中断导致轴突肿胀,然后是次级轴突断开和沃勒氏退变。轴突细胞骨架的这些修饰中断了轴浆运输机制,导致运输产物逐渐聚集,从而产生轴突肿胀和神经元稳态的改变[6-7]。重度自由体质量下降模型的认知功能障碍更为严重。与重度自由体质量下降组相比,重度对照皮质撞击组的脑水肿、炎症细胞因子改变和皮层神经元凋亡更为明显[8]。

在不同的TBI模型中,损伤严重程度的参数包括压力峰值、持续时间等力学参数,以及神经系统改变(呼吸暂停、扶正反射时间、耳廓反射等)、体质量减轻、颅内压增量等生理变化、组织学改变(梗死体积和神经元丧失)、神经系统严重程度评分(NSS)和运动功能测试等行为变化[9]。mNSS包括感觉测试、运动测试、反射测试和束平衡测试,用于评估在运动、地面行走、感觉、运动协调、反射和异常运动等方面的神经系统缺陷和神经系统损伤等级[10],自由落体冲击压力的分级导致神经系统评分和平衡功能损伤严重程度的进展。各种不同程度的冲击力和加速度可产生不同程度的神经和运动损伤以及轴突炎症和损伤[11]。本实验正是应用改良的Feeney自由落体损伤模型,模拟新型皮质损伤及弥漫性轴索损伤,以探索建立稳定可靠、简便易行、可重复性的TBI动物模型,为下一步临床研究奠定基础[12]。

寻找诊断和TBI分期的血液标志物,评估TBI和生存时间间隔的免疫组化标志物,一直引起人们极大的兴趣。β-淀粉样前体蛋白(Beta-amyloid precursor protein,β-APP)是一种跨膜糖蛋白,是神经元细胞的正常成分。它经过高尔基体的加工,沿轴突快速顺行运输[13-14]。其功能包括细胞黏附、生长、神经保护和损伤反应(促进轴突萌发、突触发生、轴突生长)。是目前检测外伤性轴突损伤的“金标准”。因为它非常敏感,在创伤性脑损伤后2 h内可识别阳性反应。β-APP是致死性脑外伤外伤性轴突损伤的敏感标记物。轴突损伤首先表现为在扩张的轴突、肿胀和扭曲的轴突及轴突鳞茎中β-APP蛋白的积累,与其他研究一致。在存活2 h时观察到轴突损伤为扩张轴突,而在存活12～24 h后,受损轴突严重肿胀,类似轴突鳞茎。本实验证明,在死后检查中,β-APP免疫反应升高是DAI的标志。在没有肉眼可见的TBI情况下,β-APP的增加表明,即使是轻微的头部损伤也可能导致神经元水平的损伤,在常规的法医解剖和组织病理学检查中可能无法诊断[15-16]。Hortobagyi[17]和同事利用抗原检索法证明,在颅脑损伤后35～60 min的创伤后生存中,β-APP免疫反应可以检测早期轴突损伤。

GFAP免疫反应性表明创伤的严重程度与GFAP免疫阳性之间存在相关性[18]。GFAP是一种存在于白质和灰质的星形胶质细胞中的细胞骨架单丝蛋白。GFAP也存在于非神经胶质细胞和非中枢神经系统细胞中,如无髓鞘的雪旺细胞、软骨细胞、睾丸间质细胞、肠胶质细胞、足细胞、系膜细胞、肝脏和胰腺等星形细胞。GFAP作为一种来自钙蛋白酶和半胱天冬酶的分解产物,特别是caspase-3、6和9[19]。GFAP是成人大脑中主要的支架蛋白,是成熟星形胶质细胞的特征蛋白。在发育过程中,GFAP由放射状胶质细胞表达。这些双极性细胞位于心室区,具有神经干细胞的功能。诱导表达GFAP或抗GFAP免疫标记染色的结构相关蛋白,以及创伤后脑肿胀的结果。同样,神经元中的GFAP以前主要在亚急性和迟发性脑外伤中检测到,在急性死亡仍有阳性表达。多项研究和某些神经干细胞中GFAP表达模式为神经元表达GFAP mRNA的能力提供了证据[20]。本实验中β-APP及GFAP免疫组化阳性表达在相关研究均有证实。

本实验大鼠创伤后神经行为学评分具有良好的统计学意义,病理学大体观察及HE染色模拟皮质损伤及弥漫性轴索损伤,具有水肿性、出血性、坏死性等改变,为后续的临床干预提供基础。通过β-APP、GFAP免疫学实验,证明该损伤模型与同类实验有良好相关性,因此,该TBI动物模型稳定可靠、简便易行,具有良好的可重复性。