杰氏棒杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶半理性改造及全细胞催化合成β-丙氨酸

刘浩 马世杰 周哲敏 崔文璟

（江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）

β-丙氨酸，又称3-氨基丙酸，是生物体内合成泛酸的重要前体物质，也是自然界中唯一存在的β型氨基酸。β-丙氨酸及其衍生物广泛应用于制药，如合成帕米磷酸钠［1］、肌肽［2］等，以及食品、饲料和化工等领域［3-4］，被认为是12种最具发展潜力的三碳化合物之一［5］，市场需求量日益上升。通过PanD催化L-天冬氨酸制备β-丙氨酸是主要途径之一，具有重要的工业应用价值，相较于化学合成法，生物转化法更加绿色、可持续。

L-天冬氨酸-α-脱羧酶（L-aspartate-αdecarboxylase, EC 4.1.1.11, PanD, ADC）能够专一地催化L-天冬氨酸脱去α羧基生成β-丙氨酸。ADC酶最早是由Williamson等［6］从Escherichia coli中分离得到。随后Chopra等［7］异源表达了结核分歧杆菌来源的PanD，并首次进行了结晶。PanD主要存在于细菌、古细菌、放线菌等低等生物中，目前对PanD的报道主要集中在大肠杆菌［8］、谷氨酸棒状杆菌［9］（Corynebacterium glutamicum）、枯草芽孢杆菌［10］（Bacillus subtilis）、结核分枝杆菌［11］（Mycobacterium tuberculosis）、幽门螺旋杆菌［12］（Helicobacter pylori）等。PanD可分为磷酸吡哆醛（PLP）依赖型和丙酮酰基团依赖型两类，磷酸吡哆醛依赖型PanD催化过程中依赖于辅因子PLP，主要来源于Tribolium castaneum、果蝇（Drosophila melanogaster）等真核生物，蛋白结构和催化机理尚无明确报道［13］，而丙酮酰基团依赖型PanD的催化能力依赖自加工形成的丙酮酰基团，无需外源辅助因子，且催化特异性高，相较于磷酸吡哆醛依赖型更具工业应用前景。丙酮酰基团依赖型PanD 合成时，首先转录翻译成无活性的原酶（约15 kD），随后在Gly24-Ser25处发生断裂，自剪切形成1个C端含有羟基的β-亚基（约3 kD）和1个N端含有丙酮酰基的α-亚基（约12 kD）［14-16］。

目前关于PanD的克隆表达、分子改造及应用等方面的研究逐渐升温，张潇潇［17］成功在E.coli BL21（DE3）菌株中异源表达了顿齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）来源的PanD 基因，催化生产β-丙氨酸，最终浓度达到76.47 mg/L。范雪萍等［18］将特基拉芽孢杆菌（B.tequilensis）来源的PanD 在E.coli BL21（DE3）中重组表达，以200 g/L L-天冬氨酸作为底物，β-丙氨酸的最终产量达66.4 g/L。Li等［19］构建了过量表达谷氨酸棒杆菌ADC的大肠杆菌重组菌，全细胞催化生产β-丙氨酸，产量达到24.8 g/L。Zhang等［20］基于酶结构与功能关系，将B.subtilis来源PanD的56号位点突变为丝氨酸，最终比酶活达到7.8 U/mg。Pei等［21］通过易错 PCR对B.subtilis来源PanD进行改造，成功筛选到V68I以及I88M两个突变体，其酶活相比野生型提高了18%-22%；陈虹［22］对T.castaneum来源的PanD进行建库筛选，筛选到两个酶活明显提高的突变体，最终267 g/L的底物L-天冬氨酸可生成170.53 g/L的β-丙氨酸，转化率达到95.45%。现有对L-天冬氨酸α脱羧酶的改造普遍存在酶活力低［23-28］的问题，这是限制其工业应用的关键性因素。因此，寻找初始活性较高的L-天冬氨酸α脱羧酶，并定向进化改造PanD基因进一步提高催化效率，对酶法合成β-丙氨酸具有重要的研究意义和工业价值。

本研究以杰氏棒杆菌（Corynebacterium jeikeium）来源的PanD基因为研究对象，通过半理性设计手段对其定向进化，获得了酶学性质显著提升的突变体酶，并利用全细胞催化技术实现了β-丙氨酸的高效合成，对酶法生产β-丙氨酸以及微生物发酵法合成β-丙氨酸下游产物（泛酸、肌肽等）具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌表达宿主菌E.coli BL21（DE3）、克隆宿主菌E.coli JM109、重组质粒pET-28a（+）为本实验室保存。种子培养基为LB培养基。Corynebacterium jeikeium来源的PanD基因由安升达公司合成。L-天冬氨酸钠、IPTG、卡那霉素购于上海生工生物工程有限公司。β-丙氨酸（购于Sigma公司）。酵母提取物、蛋白胨购于Oxford公司。异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate, PITC）购于阿拉丁公司。

蛋白纯化仪和纯化柱，GE Healthcare UK Ltd；Bio-Rad PCR仪器；日立高效液相色谱仪。

1.2 方法

1.2.1 同源建模和分子对接 将杰氏棒杆菌来源L-天冬氨酸α脱羧酶的氨基酸序列（GenBank登录号：CR931997.1）上传至AlaphFold2在线服务器进行结构预测。L-天冬氨酸α脱羧酶分子与配体L-天冬氨酸分子对接通过Maestro半柔性对接实现。

1.2.2 计算机模拟突变及虚拟突变位点的选择 通过Rosetta软件进行虚拟突变，对各位点解折叠自由能变化（ΔΔG）结果进行统计，筛选突变后折叠自由能（ΔG）下降显著的位点。在Uniprot数据库中通过BLAST寻找筛选PanD的高同源性蛋白，ClustalX2软件对这些蛋白进行多序列同源比对分析［21］，剔除高保守位点。

1.2.3 突变体文库构建方法 以野生型CJPanD基因的重组质粒pET28a（+）-PanD为模板，设计NNK简并密码子引物，通过高保真聚合酶Prime STAR Max DNA Polymerase进行全质粒PCR。采用Dpn I酶于37℃对PCR产物进行酶切以消化野生型模板，随后转化克隆宿主菌E.coli JM109，涂布于平板上，待平板上长出菌落后，悉数洗下平板上的菌落，提取混合质粒，即为突变体文库，再将混合质粒导入表达宿主菌E.coli BL21（DE3），涂布于平板上。挑取平板上的单菌落，接种于96孔板中，培养一段时间后，转接至另一96孔板中，约2-3 h后，加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG诱导，继续培养12 h取出，作为突变体库备用。

1.2.4 突变体的初筛和复筛

1.2.4.1 突变体的初筛 将培养12 h的96孔板取出，离心去上清后，加入500 μL，浓度为100 mmol/L的L-天冬氨酸钠溶液，放入37℃摇床反应30 min后取出，再次离心，上清即为全细胞反应液。突变体的初筛采用薄层层析，薄层层析是在薄板上进行的一种层析分离方法，其原理是溶液中各组分在固定相和流动相中的溶解度不同，在薄板上的迁移也不同，从而达到分离的目的，筛选突变体时用来定性非常方便。在距离薄板下端边缘1.5 cm处划线，样品间隔1 cm，点样1 μL，先点上底物L-天冬氨酸和产物β丙氨酸，再依次点上全细胞反应液，置于层析杠中，加入展开剂，展开剂没过薄板下端边缘1 cm左右，层析约3 h，停止层析。取出薄板，用吹风机吹干表面的展开剂后均匀地喷上茚三酮-乙醇溶液，再使用吹风机吹至出现蓝紫色斑点，即可进行观察定性。

1.2.4.2 突变体的复筛 对初筛有效果的突变体进行纯化，测定纯酶酶活。

1.2.5 酶的表达与纯化 将重组大肠杆菌pET28a-CJPanD-BL21、pET28a-CJPanD-L39A-BL21的单克隆接种于5 mL LB培养基（含有50 μg/mL卡那霉素）中，置于37℃、200 r/min的摇床中，过夜振荡培养，作为种子液。按1%（体积分数）接种量接种于含有50 μg/mL卡那霉素的100 mL LB培养基中，37℃、200 r/min，振荡培养至OD600为0.6-0.8。加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG，在25℃条件下诱导表达16-18 h左右。利用AKTA蛋白纯化仪和His Trap HP纯化柱对目的蛋白进行分离纯化。收集细胞培养液，12 000 r/min离心5 min，弃去上清液，收集沉淀。用Binding缓冲液（20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑）重新悬浮细胞，置于冰上进行超声波破碎，待溶液澄清之后，于4℃、12 000 r/min离心30 min，收集细胞破碎上清液。上清液经0.45 μm滤膜过滤后作为粗酶液上样，用Binding缓冲液洗去非结合蛋白，用15个柱体积的Elution缓冲液（20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑）进行线性洗脱，收集洗脱峰。将收集到的蛋白放入50 mmol/L磷酸盐（pH 7.0）缓冲液中，4℃过夜透析除去咪唑。利用浓度为15%的SDS-PAGE对分离纯化后的蛋白进行电泳检测，利用Brandford法测定目的蛋白浓度。

1.2.6 L-天冬氨酸和β-丙氨酸检测 L-天冬氨酸和β-丙氨酸采用异硫氰酸苯酯（PITC）进行衍生。L-天冬氨酸和β-丙氨酸经衍后采用HPLC测定，色谱柱为DiKMA Diamonsil C18（2）（5 μm × 4.6 mm ×250 mm）；流动相A溶液为80%（体积分数）乙腈水溶液，流动相B为97∶3（体积分数，pH 7.0）的0.1 mol/L醋酸钠-乙腈溶液；梯度洗脱：0-30 min，B溶液由95%下降至70%；35-40 min，B溶液由70%上升至95%；40-42 min，B溶液梯度保持不变，检测波长为254 nm，柱温为40℃。

1.2.7 酶学性质测定

1.2.7.1 最适温度测定 将0.1 mg重组酶分别置于30、37、40、45、55、60、65、70、80℃金属浴中预热5 min，然后与同样预热过5 min的pH 7.0的200 mmol/L底物L-天冬氨酸钠反应10 min，测定酶活后分析酶的最适反应温度。

1.2.7.2 温度稳定性测定 将0.1 mg重组酶液置于30、37、40、50、55、60、70、80℃孵育30 min后，置于冰上冷却5 min。加入终浓度 200 mmol /L L-天冬氨酸钠，于37℃，pH 7.0条件下反应10 min 测定残余酶活。将初始酶活定义为100%，分析温度对酶稳定性的影响。

1.2.7.3 最适pH测定 将0.1 mg重组酶置于37℃金属浴预热5 min，预热后分别加至pH 3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0的缓冲液中，缓冲液中含有200 mmol/L底物L-天冬氨酸钠，反应10 min，测定酶活性，分析酶的最适反应pH。

1.2.7.4 pH稳定性测定 将0.1 mg重组酶液置于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液中，孵育60 min后，加入终浓度 200 mmol /L L-天冬氨酸钠，于37℃，pH 7.0条件下反应10 min测定残余酶活。将初始酶活定义为100%，分析pH对酶稳定性的影响。

1.2.7.5 动力学常数测定 在终浓度100 μg/mL纯酶液中，分别加入终浓度（1、2、5、10、20、50、80、100、200、400 mmol/L）L-天冬氨酸钠，于37℃，pH 7.0条件下，反应5 min，100℃、15 min终止反应，检测β-丙氨酸产量，测定初始反应速率。采用GraphPad Prism9软件拟合曲线，测定动力学常数Km，Kcat。将在37℃，pH 7.0的条件下，每分钟转化L-天冬氨酸钠生成1 μmol β-丙氨酸所需酶量定义为一个酶活力单位U。

1.2.8 突变体结构分析 通过Pymol软件分析正向突变酶的空间结构变化，推测分析PanD酶学性质的变化与蛋白分子结构改变的联系。

1.2.9 全细胞催化合成β-丙氨酸的体系优化 重组菌细胞经培养诱导后，离心收集，浓缩到OD600=40。在37℃，5 mL反应液（pH 7.0）中，加入L-天冬氨酸钠固体粉末至终浓度1.5 mol/L，持续振荡。每隔一段时间取样测定L-天冬氨酸剩余量和β-丙氨酸的生成量，并由此计算转化率和产量。

2 结果

2.1 杰氏棒杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶在大肠杆菌中的表达与纯化

将合成的目的基因连接到pET28a（+）T7启动子下游后，获得重组质粒pET28a（+）-CJPanD，将上述重组质粒转化到E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，获得重组菌E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）-CJPanD。将构建好的质粒导入表达宿主E.coli BL21（DE3），重组菌在大肠杆菌中表达纯化结果见图1，CjPanD重组表达后自剪切形成1个C端含有羟基的β-亚基（约3 kD）和1个N端含有丙酮酰基的α-亚基（约12 kD）。

图1 重组酶CJpanD及突变体蛋白电泳Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme CJpanD and mutants

2.2 计算机模拟突变

蛋白质的解折叠自由能ΔG是蛋白质稳定性的重要参数。若突变后的ΔG较野生型下降，则表明该突变有利于提高蛋白质的稳定性；若突变后ΔG增加，则说明该突变不利于蛋白质的稳定。排除高保守位点H11后，确定C26、L39、I49、N72、L55和T56共6个突变热点，相关位点的折叠自由能变化如表1。

表1 拟突变氨基酸的选取Table 1 Selection of pseudo-mutant amino acids

2.3 突变体文库的初筛和复筛

根据计算机模拟突变结果，设计饱和突变引物，简并密码子为NNK，构建含有上述突变位点的质粒，在96孔板中的反应后点于薄板上，部分薄层层析初筛结果如图2所示，对初筛的正向突变体进行测序，筛选到C26L、C26F、L39A、I49L、L55F、T56W、N72。

图2 薄层层析结果Fig.2 Results by thin layer chromatography

对初筛有效果的正向突变体进行复筛验证，在37℃，底物L-天冬氨酸浓度200 mmol/L的条件下测定重组酶的比酶活（图3），经过实验验证，L39A突变体的比酶活是野生型的1.4倍。

图3 不同突变体比酶活Fig.3 Specific enzyme activity in different mutants

2.4 突变体的酶学性质表征

2.4.1 最适温度及温度稳定性、最适pH及pH稳定性的表征 为了考查野生型酶和L39A突变体的最适温度和温度稳定性，将底物L-天冬氨酸钠和重组酶分别在对应温度下孵育5 min后再混合到一起反应，以未经处理的酶作为对照，测定酶活。数据经处理后，由图4-A可知，野生型和突变体的最适温度为55℃，70℃下突变体L39A的活性仍然高于最适温度下野生型活性。由图4-B可知，在50℃孵育30 min后，野生型的活性保持在90%，而在70℃孵育情况下，野生型仅剩余20%的酶活；而突变体L39A稳定性有所提高，70℃处理后仍剩余50%的酶活。

图4 最适温度及温度稳定性、最适pH及pH稳定性Fig.4 Optimal temperature and temperature stability, optimal pH and pH stability of recombinant enzymes

为了考查L39A突变体的最适pH以及pH稳定性，将不同pH的含底物L-天冬氨酸钠的缓冲液与重组酶在37℃孵育5 min后混合到一起反应，测定酶活。数据经处理后，由图4-C可知，野生型与突变体L39A的最适pH为6.0-6.5，最适pH下，突变体酶活较野生型提升1.3倍。由图4-D可知，在pH 6.0-7.0之间酶活保持稳定，当pH低于5.5或高于7.5时，残余酶活低于60%。

2.4.2 突变体动力学常数的测定 测定突变体L39A的动力学参数（图5）并与野生型进行比较，具体结果如表2所示，野生型的Km为（3.63±0.12）mmol/L，Kcat为（102.10±0.37）s-1。突变体L39A的Km值较WT低，表明其底物亲和力优于野生型；Kcat/Km较野生型更高，催化效率有显著提升，是野生型的1.4倍。

表2 动力学常数测定Table 2 Kinetic parameters of WT and L39A

2.5 突变体的结构模拟与分析

对突变位点L39A进行结构分析发现（图6），L39A与底物之间并没有直接的相互作用，但是39位的丙氨酸与42位的谷氨酸的羟基氧原子和氮原子之间形成两个氢键，其羟基氧和羰基氧与7位赖氨酸形成两个氢键，稳定了42位谷氨酸空间取向；42位谷氨酸与59位丙氨酸之间形成氢键，57位苏氨酸、58位酪氨酸位参与底物的结合，39位取代为侧链基团更小的丙氨酸，亲水性增强，增加了关键催化氨基酸58位酪氨酸与其他氨基酸的相互作用，使活性中心周围的区域稳定性提高，从而提高了催化活性。此外39位亮氨酸突变为丙氨酸后，结合自由能降低，PanD酶分子与底物结合更加容易。

图6 突变体L39A和野生型结构信息Fig.6 Structural information of L39A and WT

2.6 全细胞催化合成β-丙氨酸

在含有重组大肠杆菌细胞OD600=40的反应液中，一次性添加L-天冬氨酸钠进行全细胞催化反应，定时取样监测底物与产物的含量。由图7可知，转化初期速度较慢，转化中期速度加快，可能是细胞发生裂解，胞内的酶释放出来，转化后期转化效率降低，可能是酶出现了不可逆的失活。当一次性添加1 mol/L的L-天冬氨酸钠进行全细胞催化反应时，如图7-A,B所示，L39A在4 h基本上能够转化70%的L-天冬氨酸，而野生型4 h仅能转化约50%，L39A在10 h能够转化90% L-天冬氨酸，在12 h能够完全转化1 mol/L的L-天冬氨酸，野生型在15 h能完全转化1 mol/L的L-天冬氨酸，两者在转化性能方面的差距较明显。

图7 全细胞催化合成β-丙氨酸Fig.7 Whole cell catalytic synthesis of β-alanine

而当一次性添加1.5 mol /L的L-天冬氨酸钠作为底物进行全细胞催化反应时，L39A在26 h摩尔转化率达52%，而野生型摩尔转化率仅为28%，L39A在26 h的最终产量为71.22 g/L，野生型为37.55 g/L（图7-C, D，表3）。此种体系中酶的转化效率变慢，可能是由于该类酶普遍存在不同程度的底物抑制。但这种体系下，突变体L39A在全细胞转化方面显现出优于野生型的催化和转化性能。

表3 一批次26 h转化率与产量Table 3 Conversion and yield at 26 h per batch

3 讨论

目前，生物发酵法生产β-丙氨酸是主要的研究热点，该方法反应条件温和、绿色安全；该法主要有两类：一类是通过微生物代谢生产β-丙氨酸，但是经过微生物代谢后，副产物较多，难以分离纯化且微生物代谢转化效率低［29］；另一类是通过酶专一性催化生产β-丙氨酸，该方法仅需一步转化即可得到产物，易于产物的分离纯化，但存在酶活低、机理性失活、底物抑制等问题。针对酶生物转化存在的问题，本文通过挖掘新酶寻找初始活性高的酶；通过定向进化提高酶的催化效率及稳定性。本文利用已报道的谷氨酸棒状杆菌［8］（Corynebacterium glutamicum）、枯草芽孢杆菌［9］（Bacillus subtilis）来源的PanD基因为探针，在Uniprot数据库中进行BLAST，分析活性中心位点周围氨基酸序列的保守性，选择自裂解后形成丙酮酰结构的基因序列，以起始活性为标准，筛选到来源于杰氏棒杆菌（Corynebacterium jeikeium）的PanD。

酶的实验室定向进化是在实验室模拟自然环境加速酶进化的技术［30］，主要有位点饱和突变［31］和易错PCR［32］，这两种方法能够产生非常大的突变体文库，但是需要依赖于分辨率较高的高通量筛选手段［33］，若没有合适的高通量筛选手段，定向进化过程将非常棘手。半理性设计借助蛋白质的保守性位点以及晶体结构，选取若干氨基酸作为潜在位点，构建“小而精”的突变体文库［34］。确定了定向进化模板后，由于杰氏棒杆菌来源PanD尚未有明确的结构作为参考，AlphaFold2在蛋白质预测方面表现优秀［35］，具有惊人的准确度，本文通过AlphaFold2预测杰氏棒杆菌来源PanD结构，并通过Rosetta进行虚拟筛选，根据蛋白质的解折叠自由能并结合保守性分析，进一步缩小了突变位点的范围，提高了定向进化的效率。薄层层析能够比较直观地对氨基酸浓度进行定性，浓度越高，斑点越大。对突变体文库进行初筛和复筛后，筛选到突变体L39A，突变体催化效率是野生型的1.4倍。研究中还发现，突变体酶活提高的同时，稳定性也有所提高，在50℃孵育30 min后，野生型的活性保持在90%，而在70℃孵育情况下，野生型仅剩余20%的酶活；而突变体L39A 70℃处理后仍剩余50%的酶活，更加有利于工业生产。为了进一步了解突变体在全细胞催化方面的优势，本文在含有重组大肠杆菌细胞OD600=40的反应液中，一次性添加1 mol /L的L-天冬氨酸钠盐进行全细胞催化反应验证，L39A在4 h基本上能够转化70%的L-天冬氨酸，而野生型4 h仅能转化约50%，L39A在10 h能够转化90% L-天冬氨酸，在12 h能够完全转化1 mol/L的L-天冬氨酸，具有工业应用的潜力。结构分析表明，39位的丙氨酸与42位的谷氨酸的氧原子和氮原子之间形成两个氢键，其羟基氧和羰基氧与7位赖氨酸形成氢键，稳定了42位谷氨酸空间取向，42位谷氨酸与59位丙氨酸之间形成氢键，57位苏氨酸、58位酪氨酸参与底物的结合，39位取代为侧链基团更小的丙氨酸，亲水性增强，增加了关键催化氨基酸58位酪氨酸与其他氨基酸的相互作用，使活性中心周围的区域稳定性提高，从而提高了催化活性。

半理性设计结合Rosetta虚拟筛选策略对比其他酶活性改造策略［36］，能够减少实验复杂程度、时间。对于没有确切晶体结构的分子，也可以通过AlphaFold2预测手段进行结构预测，以预测后的模型为参考进行筛选也有一定的意义，但是若想对酶进行更为深入的研究，精确的三维结构是必须的，还需要对野生型以及突变体进行晶体结构解析。

4 结论

本研究通过对杰氏棒杆菌来源L-天冬氨酸α脱羧酶进行定向进化，成功筛选到突变体L39A。L39A热稳定性较野生型有所提升，最适温度、pH与野生型一致。其与底物的亲和力提高，催化效率是野生型的1.4倍。经过全细胞催化验证，L39A在4 h能够转化70%的L-天冬氨酸，12 h能够完全转化1 mol/L的L-天冬氨酸，且催化效率的提高在高浓度底物（1.5 mol/L L-天冬氨酸）时表现得更为明显。后续可以以L39A为模板，进一步迭代突变，提高其在工业应用中的潜力。