利用酵母双杂交系统筛选水稻中与OsCRK5互作蛋白

王子颖 龙晨洁 范兆宇 张蕾

（武汉大学生命科学学院 杂交水稻国家重点实验室，武汉 430072）

水稻（Oryza sativa L.）是世界三大粮食作物之一，全球约有40%的人口以稻米作为主要粮食并广泛种植［1］，因此水稻的产量和粮食安全极为重要。在生长发育过程中，水稻会受到高温、干旱、盐胁迫等各种环境因素的影响。其中，干旱胁迫是影响水稻生长最终导致减产的重要环境因素之一［2］。

钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases, CDPKs）是植物中主要的钙离子结合蛋白，对于钙离子信号的感知和解码具有重要意义［3］。CDPKs在植物中广泛存在，其中水稻有31个CDPKs家族成员，拟南芥（Arabidopsis thaliana）中有34个，小麦（Triticum aestivum）中存在23个，玉米（Zea mays）中存在40个［4-8］。研究发现，CDPKs参与了植物发育的多个方面，如花粉管和根毛的生长、茎和根的发育、叶片衰老以及代谢等过程。同时，CDPKs还广泛参与植物生物和非生物胁迫反应［9-12］。

CRK（CDPK-related kinase）是一类在蛋白序列和结构上与CDPKs高度同源的蛋白激酶，广泛存在于植物中，如水稻、拟南芥、甜瓜（Cucumis melon L.）、毛果杨（Populus trichocarpa）、辣椒（Capsicum annuum）、油菜（Brassica rapa.）以及番茄（Lycopersicon esculentum）等［13-17］。其中，拟南芥中CRK 功能的研究取得了一定的进展。研究发现，AtCRK1能够显著提高植株对盐胁迫和高温的抵抗能力［18］。Baba等［19］对crk1突变体进行连续光照发现，突变体表现出侏儒症及萎黄病特征，表明AtCRK1还参与了光调控的植物生长发育过程。AtCRK2通过影响赤霉素受体蛋白（GID1）的稳定性参与调控GA信号［20］。AtCRK3的互作蛋白AtGLN1;1在叶片衰老过程中发挥作用［21］。AtCRK5可以通过磷酸化PIN2调节生长素的运输，进而参与调控根的向重力性生长［22］。水稻中CRKs的研究相对较少。Yadav 等［23］利用定量PCR和RNA原位杂交技术检测了水稻CRK基因在不同组织和器官中的表达情况，结果表明CRK家族成员的表达具有组织特异性。

酵母双杂交系统于1989年首次开发，距今已有30年多的时间，但它依然是鉴定和验证蛋白质互作的最常见和最直接的方法［24］。该系统最大的优点是待测蛋白在实验过程中能够保持天然构象，从而提高了检测的准确性和灵敏度［25］。这项技术的基本原理是，两种待测蛋白分别与DNA结合域或转录激活域融合表达，当两个融合蛋白之间发生相互作用时，转录激活因子能够激活报告基因的表达，使酵母可以在缺陷型培养基上继续生长。通过酵母菌斑的生长状态可以判断两种待测蛋白是否存在相互作用［26］。

实验室前期研究发现OsCRK5参与了水稻干旱胁迫反应，但是具体的分子机制尚不清楚。本研究通过酵母双杂交系统筛选OsCRK5的互作蛋白，并通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验进一步验证蛋白互作的可靠性，为阐明OsCRK5调控水稻抗旱的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：酵母菌Y2H Gold、AH109；大肠杆菌DH5α；农杆菌GV3101。

植物材料：水稻品种为粳稻Hejiang19。

载体：酵母双杂交系统为美国Clontech公司的Yeast Two-Hybrid System，文库载体为pGADT7，诱饵载体为pGBKT7，阳性对照载体为pGBKT7-53和pGADT7-T，阴性对照载体为pGBKT7-53和pGADT7-Lam。

水稻cDNA酵母文库：由武汉大学生命科学学院杨红春实验室赠送。

培养基：酵母缺陷培养基购于北京酷来搏科技有限公司。酵母全培养基YPDA和细菌LB培养基所使用的蛋白胨及酵母提取物购于英国OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 干旱处理水稻幼苗 将野生型Hejiang 19和OsCRK5-RNAi转基因植株的种子灭菌后放置在MS固体培养基上萌发，在30℃恒温光照培养箱中培养一周。将一周大的水稻幼苗从MS固体培养基上转移到水培液中继续在培养箱中培养。待植株生长至20 DAG后，向水培液中加入20% PEG4000模拟干旱环境。对干旱处理后植株表型进行观察，并在固定时间点取材，提取RNA并反转为cDNA，以cDNA为模板进行定量PCR分析。

1.2.2 pGBKT7-OsCRK51-444诱饵载体构建和自激活检测 以cDNA为模板，用引物OsCRK51-444-pGBKT7 FP:5′-CATGGAGGCCGAATTCATGGGGCA GTGTTACGC-3′和OsCRK51-444-pGBKT7 RP:5′-GCA GGTCGACGGATCCGCACTCATCTCGCAACC-3′扩增OsCRK5基因的1-1 332 bp片段，该片段编码OsCRK5蛋白的1-444氨基酸序列。扩增的片段5′和3′端均与线性化载体pGBKT7的末端同源。利用重组的方法，将扩增的OsCRK5基因片段构建到诱饵载体pGBKT7。

将pGBKT7空载体与pGBKT7-OsCRK51-444诱饵载体分别转化酵母Y2H Gold感受态细胞，酵母感受态制备与转化的步骤参考Yeastmaker Yeast Transformation System 2操作手册。将部分转化菌液涂布于SD/-Trp+X-α-gal+AbA固体培养基，30℃倒置培养2-3 d，观察菌斑颜色。另取部分转化菌液，稀释后滴加在SD/-Trp和SD/-Trp/-Leu/-His固体培养基上，30℃倒置培养2-3 d，观察菌斑生长状态。从菌斑颜色和生长状态判断诱饵载体蛋白是否具有自激活能力。

1.2.3 酵母总蛋白的提取和诱饵蛋白表达的检测 挑取多个含有诱饵载体的单克隆菌斑进行培养，然后分别提取酵母总蛋白，使用Western blot方法检测诱饵蛋白的表达。用Myc抗体（小鼠单克隆抗体）作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，使用HRP-DAB显色试剂盒进行显色。

1.2.4 酵母cDNA文库筛选互作蛋白 根据Western blot的实验结果，选择诱饵蛋白表达量最高的酵母菌株进行后续实验。参照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作手册，将1 mL水稻cDNA酵母文库与含有诱饵载体pGBKT7-OsCRK51-444的酵母感受态细胞混合，培养16 h，将菌液均匀涂布到SD/-Trp/-Leu/-His三缺固体培养基上。30℃倒置培养5 d。挑取阳性菌斑，接种到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade+X-α-gal+AbA四缺固体培养基上，30℃倒置培养3 d。长出阳性菌斑的固体培养基在4℃保存备用。

1.2.5 酵母质粒提取和鉴定 将四缺固体培养基上的阳性菌斑接种到液体培养基中进行培养，然后提取质粒。以质粒为模板，用pGADT7载体上的特异鉴定引物（FP：5′-CGATGATGAAGATACCCCAC-3′；RP：5′-GAAATTGAGATGGTGCACG-3′）进行PCR扩增，将PCR产物送擎科生物公司测序。利用NCBI网站上的Blastn功能对测序结果进行比对分析。

1.2.6 酵母双杂交验证蛋白互作 以水稻cDNA为模板，分别用特异引物pGADT7-OsDi19-1 FP：5′-CG GGATCCATCGAGTGATGGACTCGGAGCACTGGAT-3′和pGADT7-OsDi19-1 RP：5′-ACGATTCATCTGCAG ATCTCCAAATAAAGTAGTGAGCAGC-3′、pGADT7-OsWR1 FP：5′-ACGGGATCCATCGAGTGATGGTACA GCCAAAGAAGAA-3′和pGADT7-OsWR1 RP：5′-AC GATTCATCTGCAGTCAGATGACAAAGCTACCCT-3′进行片段扩增，将扩增后的OsDi19-1和OsWR1 CDS全长序列分别构建到pGADT7载体中。将pGADT7-OsDi19-1和pGBKT7-OsCRK5、pGADT7-OsWR1和pGBKT7-OsCRK5转化酵母细胞。转化后的菌液稀释不同倍数后滴加到二缺、三缺和四缺固体培养基上，观察菌斑生长状况。pGADT7-T和pGBKT7-53质粒共同转化的酵母菌作为阳性对照，pGADT7-T和pGBKT7-Lam质粒共同转化的酵母菌作为阴性对照。

1.2.7 荧光双分子互补实验（BiFC）验证蛋白互作 利用同源重组的方法，将OsDi19-1的CDS全长构建到pSPYNE-35S载体中。扩增OsDi19-1 CDS序列使用的引物序列为：pSPYCE-35S-OsDi19-1 FP：5′-ACTGTCGACCTCGAGATGGACTCGGAGCACTGG AT-3′和pSPYCE-35S-OsDi19-1 RP：5′-CATCCCGG GAGCATCTCCAAATAAAGTAGTGAGCAGC-3′。使用同样的方法将OsWR1的CDS全长构建到pSPYNE-35S载体中。扩增OsWR1 CDS目的片段使用的引物序列为：pSPYCE-35S-OsWR1 FP：5′-AACACGGG GGACATGGTACAGCCAAAGAAGAA-3′和pSPYCE-35S-OsWR1 RP：5′-AGCCCGGTTAACGATGACA AAGCTACCCT-3′。同时将CRK51-626片段构建到pSPYCE-35S载体中。使用的引物序列为pSPYNE-35S-OsCRK51-626FP：5′-ACTGTCGACCTCGAGGG TACCATGGGGCAGTGTTACGC-3′和pSPYNE-35SOsCRK51-626RP：5′-CATCCCGGGAGCGGTACCCCGC CTCGCGTTGCTA-3′。

pSPYNE-35S-OsCRK51-626、pSPYCE-35S-OsWR1和pSPYCE-35S-OsDi19-1分别转化到农杆菌GV3101中。将携带pSPYNE-35S-OsCRK51-626和pSPYCE-35S-OsWR1（或者pSPYNE-35S-OsCRK51-626和pSPYCE-35S-OsDi19-1）的农杆菌菌液混合后注射到小叶烟草叶片中，避光培养12-16 h，然后在光照条件下继续培养1-2 d。激光共聚焦显微镜下观察实验结果。

2 结果

2.1 OsCRK5-RNAi转基因植株具有干旱敏感表型

20% PEG处理水稻幼苗30 min后，OsCRK5基因在野生型水稻叶片中的表达水平明显上升（图1-A）。相比于野生型水稻，此时OsCRK5-RNAi转基因植株的叶片失水明显，卷曲严重（图1-B, C）。同时，干旱诱导表达的基因OsLEA3和OsDREB2A在OsCRK5-RNAi转基因植株中上升程度明显低于野生型（图1-D）。上述结果表明OsCRK5在水稻的干旱胁迫调控中发挥重要作用。

2.2 pGBKT7-CRK51-444诱饵载体的自激活测试

携带pGBKT7-CRK51-444质粒的酵母菌斑在SD/-Trp+X-α-gal培养基上正常生长且不变蓝（图2-A）。同时，含有pGBKT7-CRK51-444诱饵载体的酵母菌斑与含有pGBKT7空载体的阴性对照在三缺固体培养基上均不能正常生长（图2-B）。上述结果说明pGBKT7-CRK51-444在Y2H Gold菌株中不存在自激活活性，可以作为诱饵载体进行后续的文库筛选。

图2 pGBKT7-OsCRK51-444质粒在酵母细胞中的自激活检测Fig.2 Detection of self-activation of plasmid pGBKT7-OsCRK51-444 in yeast cells

2.3 酵母全蛋白提取和诱饵蛋白的表达检测

Western blot方法检测带有Myc标签的诱饵蛋白的表达情况。结果如图3所示，2号菌斑中OsCRK5蛋白的表达量最高，因此选择2号菌落进行后续文库筛选实验。

2.4 CRK5互作蛋白的初步筛选

将诱饵蛋白表达量最高的酵母菌株（2号菌）与酵母文库菌株混合交配完成后在显微镜下进行检查。40×视野下出现约10个酵母合子，表明酵母交配已大部分完成（图4-A）。交配完成后的酵母菌液在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade+X-α-gal+AbA培养基上生长，其中的阳性菌斑呈现蓝色（图4-B）。本次筛选共得到77个阳性结果。

图4 筛选获得的部分阳性克隆Fig.4 Partial positive clones from screened

提取阳性菌株中的质粒，送擎科生物公司完成测序。经过序列分析和比对，筛选得到的部分基因和注释结果如表1所示。依照蛋白功能对这些基因编码的蛋白质进行分类，分类结果展示如图5。其中有5%的蛋白质参与能量代谢过程，5%参与细胞代谢过程，5%与细胞结构相关，21%与转录相关，21%参与蛋白质的降解和贮存，11%参与细胞生长和分裂，32%参与蛋白质的合成过程。

表1 酵母文库筛选部分互作蛋白信息Table 1 Information of part interacting proteins screened by yeast library

图5 筛选基因的功能分类Fig.5 Functional classification of screening genes

2.5 酵母双杂交验证OsCRK5与OsWR1和OsDi19-1的相互作用

利用酵母双杂交实验再次验证了OsWR1和OsDi19-1与OsCRK5之间的相互作用。结果如图6所示，pGADT7-OsDi19-1和 pGBKT7-CRK51-444以及pGADT7-OsWR1和pGBKT7-CRK51-444共转化的酵母菌株均能在四缺固体培养基上正常生长，说明OsDi19-1和OsWR1与OsCRK5在酵母中相互作用。

图6 酵母双杂交验证OsCRK5与OsDi19-1和OsWR1的互作Fig.6 Yeast two-hybrid confirmed the interaction between OsCRK5 and OsDi19-1 or OsWR1

2.6 荧光双分子实验验证蛋白互作

同时利用双分子荧光互补实验在小叶烟草的叶片表皮细胞中验证了OsCRK5与OsWR1和OsDi19-1之间的相互作用。激光共聚焦观察结果显示，OsCRK5与OsDi19-1和OsWR1在植物细胞中存在相互作用（图7）。

图7 BiFC验证OsCRK5与OsDi19-1和OsWR1的互作Fig.7 BiFC confirmed the interaction between OsCRK5 and OsDi19-1 or OsWR1

3 讨论

OsCRK5在水稻生长发育和胁迫应答反应中的调控机制尚未研究清楚。本研究发现OsCRK5-RNAi植株具有干旱敏感的表型。利用酵母双杂交系统筛选获得了与OsCRK5互作的部分蛋白，并利用酵母双杂交和BiFC实验再次验证了OsDi19-1和OsWR1与OsCRK5的互作。其中锌指蛋白Di19-1是水稻中的干旱诱导蛋白，在调节多种应激反应中发挥重要作用［46］。Su等［47］使用RT-qPCR在高温条件下验证了OsDi19-1基因的表达量发生了变化。拟南芥Di19可以调节PR1、PR2和PR5基因的表达参与干旱胁迫反应［48］。AtDi19-3促进植株抗旱和抗盐，其缺失突变体植株的根长相比于野生型较长，叶绿素和脯氨酸的含量降低［49］。另有文献报道，棉花中Di19-1/-2（GhDi19-1/-2）蛋白可以在体外被CDPK磷酸化，并且GhDi19-1/-2可能作为ABA信号通路中CDPK的下游靶蛋白发挥作用［50］。气相色谱结果表明，OsWR1可以通过调控下游基因改变长链脂肪酸和烷烃来调节蜡质合成［45］。Wang等［45］研究表明OsWR1可受ABA、干旱胁迫和盐胁迫的诱导，且过量表达OsWR1可增强蜡/角质合成相关基因的表达，使蜡质合成增加，增强植物的耐旱性。有研究报道OsWR1的同家族蛋白OsWR2可以招募组蛋白脱乙酰酶OsHDA704，并共同参与ABA信号以及蜡质的生物合成等途径［51］。

本实验成功构建了CRK5的酵母双杂交诱饵载体，并将其转化Y2H Gold酵母菌。由于某些蛋白自身能够结合转录激活因子从而直接激活报告基因的表达，本实验验证了诱饵蛋白OsCRK5的不存在自激活活性，且诱饵蛋白对酵母菌Y2H Gold无毒性作用。本实验构建的pGBKT7-OsCRK5诱饵载体满足检测蛋白质相互作用的前提条件，可利用水稻cDNA文库进行酵母双杂交筛库实验。酵母双杂交实验是筛选和鉴定互作蛋白的常用方法，但是其缺点是具有较高的假阳性［52］。本实验经过两次筛选降低了假阳性，并且通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验再次验证了OsCRK5与OsDi9-1和OsWR1存在相互作用。接下来需要进一步研究OsCRK5是如何通过互作蛋白Di19-1和WR1参与调节水稻干旱胁迫反应，进而揭示OsCRK5在水稻逆境胁迫中的分子调控机制。本研究结果为进一步研究OsCRK5的生物学功能提供了研究思路，同时为水稻抗旱的遗传改良奠定分子基础。

4 结论

利用水稻cDNA文库，筛选获得了OsCRK5的77个互作候选蛋白。从筛选得到的互作候选蛋白中选取与水稻抗旱相关的两个蛋白OsWR1和OsDi19-1，通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验进一步验证OsWR1和OsDi19-1与OsCRK5在酵母细胞和植物细胞中均存在互作关系。