改进的QuEChERS/气相色谱-静电场轨道阱质谱法测定牛乳中的71种农药残留

张申平，周 静

（上海市质量监督检验技术研究院 国家市场监管重点实验室（乳及乳制品检测与监控技术），上海 200233）

牛奶是钙和优质蛋白质的良好来源，重视牛奶在饮食中的健康促进作用已成为全球共识，人们在关注牛奶营养的同时对牛奶中农药残留等有害物质的关注度也越来越高。农药通过食物链蓄积，可能会对生物体的生理、免疫功能产生影响，并可能致畸、致癌、致基因突变［1-3］。牛奶中残留的农药主要来自饲草料、饮水、圈舍消毒、奶牛寄生虫、真菌、细菌防治用药，尤其在圈舍中使用的农药易污染挤奶设备，导致残留的农药进入牛奶原料乳。欧盟、日本、美国、澳大利亚等国家或地区持续关注牛奶中的农药残留情况，并不定期修订牛奶中农药的最大残留限量值（MRLs），限量值愈发严格［4-5］。我国《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》GB 2763 标准历经5 次修订，对牛乳中农药残留的限量种类逐步增加，2014 版仅规定了奶中狄氏剂的残留限量，2019 版制定了牛乳中116 种农药的最大残留限量值，2021 版将牛乳中农药残留限量扩展至139 种。同时GB 2763-2021［6］对牛乳中灭线磷的限量值低至0.01 mg/kg，特丁硫磷低至0.01 mg/kg，氯丹低至0.002 mg/kg，限量值的严格程度逐步趋向发达国家和地区。但GB 2763-2021规定的牛乳中139种农药残留，仅67种农药指定了检测方法，50%以上的农药缺乏标准检测方法。

我国发布的测定牛乳中农药多残留的标准方法是GB/T 23210-2008［7］《牛奶和奶粉中511种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》，但由于GC-MS 的灵敏度较低，加之基质效应的影响导致部分农药的检出限难以满足GB 2763-2021的限量值要求。文献报道的牛乳中农药残留检测主要采用三重四极杆串联质谱，结合固相萃取小柱净化［8-9］、低温冷冻液液萃取［10-11］、分散固相萃取［12］、凝胶渗透［13］和QuEChERS［14-16］等前处理方法。其中QuEChERS法具有操作简单、快速高效等优点，适用于快速处理大批量农药多残留样品。虽然现行标准方法和文献中多采用乙腈处理牛乳样品，在沉淀蛋白质的同时可降低提取液中的脂肪含量，但牛乳富含蛋白质、脂肪、糖类、磷脂，且农药残留量低，进入提取液中的少量脂肪仍会影响测定，导致基质效应较强。因此，开发牛乳中农药多残留的检测方法，明确各种农药的基质效应对于研究牛乳中农药残留现状具有积极的现实意义。

静电场轨道阱高分辨质谱可以区分基质中的杂质和色谱共流物，有利于痕量化合物的分析，降低了对样品前处理的要求，利用全扫描（Full MS）模式采集的数据文件可开展回顾性数据分析。本文在前期研究的基础上［17］，针对GB 2763-2021对牛乳中农药残留的限量情况，选取在毛细管色谱柱上有较好保留能力的71 种农药（包括吡唑萘菌胺、氟啶虫胺腈等未指定检测方法的农药），采用改进的QuEChERS 净化结合气相色谱-静电场轨道阱质谱（GC-Exactive Orbitrap MS）法对牛乳中上述71 种农药进行定量筛查，为保障乳品质量安全提供了技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱-静电场轨道阱质谱、TG-5Sil MS 气相色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm，美国Thermo Fisher公司）；PL2002电子天平（精度0.01 g，瑞士Metter Toledo 公司）；MS104S电子天平（精度0.000 1 g，瑞士Metter Toledo 公司）；Reax Control 涡旋振荡器（德国Heidolph 公司）；Centrifuge 5804 离心机（德国Eppendorf公司）。

71 种农药标准品（100 mg/L，乙腈或甲醇）购自天津阿尔塔科技有限公司；乙腈、丙酮、正己烷、甲酸（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；无水硫酸镁、氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷（C18）（40～60 µm，美国Dikma 公司）；正构烷烃（1 000 mg/L，C7～C40，北京曼哈格生物科技有限公司），微孔滤膜（0.22 µm，上海普誉科贸有限公司）。

供试样品：巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳、高温杀菌乳、调制乳购于上海市徐汇区的多个超市。

1.2 标准溶液的配制

混合标准溶液：将71 种农药标准品分为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组，移取一定量各农药标准溶液于10 mL容量瓶中，用丙酮-正己烷（体积比1∶1，下同）定容成2 mg/L的混合标准溶液，保存于-20 ℃冰箱中。

内标溶液：准确称取外环氧七氯，用丙酮-正己烷溶解定容并逐级稀释为10 mg/L 的内标溶液，保存于-20 ℃冰箱中。

空白基质标准溶液：准确吸取适量混合标准溶液，用空白样品的提取液配成系列标准溶液，现配现用。

1.3 样品前处理

称取5 g（精确至0.01 g）牛乳样品于50 mL 离心管中，加入10 mL 1.0%（体积分数）甲酸-乙腈、4.0 g 无水硫酸镁、1.0 g 氯化钠及1 颗陶瓷均质子，以300 r/min 振摇10 min，在-20 ℃冰箱中冷冻20 min，以4 000 r/min 离心2 min，转移全部上清液至含有1.0 g无水硫酸镁、400 mg C18和100 mg PSA 的离心管中，涡旋混匀5 min，以4 000 r/min 离心2 min。准确吸取2 mL 净化后的上清液至15 mL 离心管中，40 ℃下氮吹至近干，用丙酮-正己烷溶解定容至1 mL，加入10 µL内标溶液，混匀并经0.22 µm滤膜过滤后测定。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件色谱柱：TG-5Sil MS（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃/min 升至90 ℃，保持1.5 min，以25 ℃/min 升至180 ℃，保持1.5 min，以5 ℃/min 升至280 ℃，再以10 ℃/min 升至300 ℃，保持5 min；载气：氦气，纯度≥99.999%，流速：1.20 mL/min；进样口温度：300 ℃；进样量：1 µL；进样方式：不分流进样。

1.4.2 质谱条件电子轰击源：70 eV；传输线温度：260 ℃；离子源温度：280 ℃；溶剂延迟：5 min；扫描模式：Full MS。每个农药选取3 个特征碎片离子，选取其中信号最强的离子作为定量离子，其余作为定性离子。

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的优化

GB 2763-2021规定了牛乳中有机氯类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、杂环类等极性和溶解度差异较大的多种类农药的最大残留限量值，因此提取溶剂需能兼顾对多种农药的提取效果。比较了乙腈［18-19］、丙酮［20］、正己烷［21］、乙酸乙酯［22-23］、甲醇［24］、酸化乙腈［14］、酸化甲醇［25］、乙腈-水［10］等提取溶剂对多种农药的提取效果，正己烷、丙酮多用于有机氯农药的提取，乙酸乙酯对滴滴涕（59.1%）、联苯菊酯（62.5%）的提取效率较低［20］，甲醇对六六六（57.4%）的提取效率较低［24］。相比而言，乙腈对滴滴涕（88.1%）和六六六（93.7%）的提取效率较高［17］，同时乙腈可充分沉淀牛乳中的蛋白质，且对牛乳中脂质等杂质的溶解度低，可有效地降低样品杂质对仪器的污染。虽然大部分研究中以乙腈或酸化乙腈作为提取溶剂，但根据待测农药种类的不同，乙腈中加入甲酸、乙酸、三氯乙酸［7］的体积分数有所不同。实验考察了甲酸（FA）体积分数分别为0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%的乙腈（ACN）溶液对牛乳中71种农药的提取效果（表1）。结果显示：当甲酸的体积分数为0.1%和0.5%时，农药的回收率均较低，当甲酸的体积分数增至1.0%时，农药的回收率明显增加，回收率在80%～120%之间的农药达到57个。但当甲酸的体积分数继续增加时，牛乳中其他杂质的质子化几率也随之增加，导致基质增强效应较强，当甲酸的体积分数为2.0%时，回收率大于120%的农药达到23 个。根据王敬等［4］的报道，在提取过程中加入斜切面柱状陶瓷均质子能有效防止样品结块，增加提取溶剂与样品的接触面积。本实验最终采用1.0% 甲酸-乙腈为提取溶剂，同时加入1颗陶瓷均质子以提高农药的提取效果。

表1 不同体积分数的甲酸-乙腈对牛乳中71种农药的提取效果（n=3）Table 1 Spiked recoveries of 71 pesticides in milk extract with different volume fraction formic acid-acetonitrile solvents（n=3）

2.2 样品净化条件的优化

QuEChERS 法利用吸附剂与样品提取液中杂质的相互作用除去提取液中的杂质，达到减弱基质效应的目的［26］。常用的净化剂有C18、PSA、石墨化碳黑（GCB）、无水MgSO4。PSA 和C18可除去牛乳中的脂肪、有机酸、糖类等物质，GCB 对色素和某些平面结构化合物具有吸附作用，无水MgSO4可降低提取液中水的含量，减少水分对毛细管色谱柱的影响。在实验过程中发现存在较强的基质增强效应，导致部分农药的回收率大于120%，因此考虑使用C18、PSA 降低基质效应的影响。当仅使用C18时，农药的回收率见图1，C18用量由200 mg 增至400 mg 时，回收率大于120%的农药个数明显减少，回收率为80%～120%的农药增至61个；但当C18用量进一步增至500 mg时，可能由于过量的C18会吸附农药，使得32个农药的回收率低于80%。因此确定C18的用量为400 mg，在此基础上考察了PSA 用量对农药回收率的影响（图2）。发现当PSA 的用量为100 mg 时，回收率处于80%～120%之间的农药个数最多，达到60个；当进一步增加PSA 的用量时，会出现与C18相同的过度吸附情况。无水MgSO4的用量参考GB/T 23210-2008［7］，当称样量为5.0 g 时，无水MgSO4的用量为1.0 g。因此，实验确定向提取液中加入400 mg C18、100 mg PSA、1.0 g无水MgSO4，并立即涡旋混匀。

图1 C18用量对71种农药回收率的影响（n=3）Fig.1 Effect of C18 dosage on recoveries of 71 pesticides （n=3）

图2 C18用量为400 mg时PSA用量对71种农药回收率的影响（n=3）Fig.2 Effect of PSA dosage on recoveries of 71 pesticides with 400 mg C18（n=3）

2.3 质谱参数的确定

信息完善的质谱数据库对化合物定性至关重要。欧盟EC/657/2002 关于质谱定性要求每个化合物必须具有4 个确证点（IP），高分辨质谱对精确质量数进行全扫描测定，每个离子可被定义为2 个确证点，1 个定量离子和1 个辅助定性离子的确证点即可达到4 个，从而实现同时定量和定性确证［27-28］。

静电场轨道阱高分辨质谱Full MS 模式采集的数据文件具有可回顾性，在仪器方法中无需预先设定待测农药的碎片离子等信息，适合进行农药多残留分析。本文对100 µg/L的71种农药基质标准溶液进行Full MS 扫描，同步采集正构烷烃（C7～C40）的保留时间。利用解卷积技术获得质谱图，选择强度最强的离子作为定量离子，选择2～5 个碎片离子作为特征碎片离子，确保每个农药至少有6 个确证点，同时将保留时间和碎片离子信息导出至database 文件，获得农药的高分辨质谱信息库。数据库还包含同位素信息［29］，如氯元素有35Cl 和37Cl 两种形式，丰度比约为3∶1，原子量相差1.997 05 Da，其比例关系也可用于定性分析。图3 为71 种农药基质标准溶液（100 µg/L）的总离子流（TIC）图。

图3 71种农药混合基质标准溶液（100 µg/L）的总离子流图Fig.3 TIC chromatogram of 71 pesticides in mixed matrix standard solution （100 µg/L）

2.4 基质效应

实验发现牛乳提取液不净化时，有61种农药的回收率大于120%，存在基质增强效应。基质效应很难彻底消除，现有研究中通过进样前稀释、同位素内标校正、内标标准曲线校正、基质匹配标准溶液校正、加入分析保护剂等方法［30-33］减弱基质效应。本研究利用基质匹配标准曲线，并以外环氧七氯作为内标进行测定，可以很好地解决基质干扰。

2.5 线性关系、检出限与定量下限

定性测定中，目标农药的保留时间与标准色谱峰保留时间的相对误差在±2.5%以内，特征碎片离子的质量数与标准色谱峰的相对误差在±5×10-6以内。在基于精确质量数定量的高分辨质谱分析中，由于提取的色谱图基线噪音极低，因此采用信噪比方法无法定义检出限（LOD）和定量下限（LOQ）［28］。本文采用空白基质提取液逐级稀释标准溶液，直至仪器所能检出的最低浓度，将该浓度确定为方法的检出限，以标准曲线最低浓度点作为定量下限。利用空白牛奶提取液对混合标准溶液进行稀释，配制成质量浓度为5.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0 µg/L 的系列标准溶液，加入10 µL 外环氧七氯内标溶液，采用本方法进行测定。以各农药的质量浓度（x，µg/L）为横坐标，对应峰面积与外环氧七氯峰面积的比值（y）为纵坐标，分别绘制标准曲线。结果表明，甲萘威、灭蝇胺、2 甲4 氯钠、氧乐果、咪鲜胺的线性范围为10.0～200.0µg/L，其余66 种农药的线性范围均为5.0～200.0 µg/L。71 种农药的相关系数（r）均不低于0.99，精确质量数偏差均不大于2.55×10-6，检出限为1.0～2.0 µg/kg，定量下限为5.0～10 µg/kg。

2.6 回收率与相对标准偏差

利用空白牛乳样品进行加标回收实验，加标浓度分别为0.01、0.02、0.10 mg/kg，涡旋混匀后静置1 h，按照“1.3”方法进行加标回收实验，每个加标水平做6个平行，计算相对标准偏差（RSD），结果见表2。71种农药的平均回收率为59.6%～117%，RSD为1.9%～13%，除甲萘威（59.6%）的回收率较低外，其余农药满足GB/T 27404-2008［34］《实验室质量控制规范 食品理化检测》对回收率的要求。

表2 71种农药及内标化合物的质谱参数、相关系数（r）、检出限、定量下限、平均回收率及相对标准偏差（n=6）Table 2 MS parameters，correlation coefficients（r），LODs，LOQs，average recoveries and RSDs（n=6）of the 71 kinds of pesticides and internal standard compound

2.7 实际样品检测

采用本方法分析122份牛乳样品中71种农药的残留情况，牛乳样品包括27份巴氏杀菌乳、81份超高温灭菌乳、4 份调制乳、10 份高温杀菌乳。在2 份超高温灭菌乳中检出4，4'-DDE，检出率为1.6%，检出值均低于方法定量下限，其他农药均未检出。

3 结 论

本文采用QuEChERS 净化结合GC-Exactive Orbitrap MS 技术，建立了牛乳中71 种农药的快速筛查和定量检测方法。该方法操作简单，准确度和重现性好，已用于大批量实际样品检测，为确保乳品质量安全提供了准确可靠的检测手段。