连续流动分析法测定泡菜中总氮、硝酸盐、亚硝酸盐的样品处理

刘李蕾，白农恩，祁福良，杨晓燕，2，佘容，2

（1. 大理大学东喜玛拉雅研究院，云南大理 671003； 2. 云南省高校洱海流域保护与可持续发展研究重点实验室，中国三江并流区域生物多样性协同创新中心，云南大理 671003）

连续流动分析法是一种利用湿化学法，通过空气片段连续流动分析技术对液体样品理化指标进行自动分析的新手段，因具有高效，便捷，精密度、准确度高的特点，成为当前水质理化指标测定的首要选择[1-3]。连续流动分析仪具备自动稀释和过滤样品的功能优势，但是在实际操作过程中，由于蠕动泵管吸取样品量及滤膜使用寿命受限，若样品不均匀或存在较大颗粒，极易造成滤膜损坏、泵管堵塞、测定效率低下、测定值不准确等问题[1-2]，因此连续流动分析法样品处理格外重要。

胶体为一类介于粗分散系和溶液之间的分散体系，如牛奶、豆浆等都具有胶体特性[3-7]，生产实践和科学研究通常需要分析胶体类样品的理化性质。胶体因存在较大颗粒物以及絮状物，导致液体极易不均匀，无法满足连续流动分析法的测定条件，需要对胶体样品进行均质化处理。胶体类样品的处理难以通过常见的沉降、过滤和澄清等机械分离方法实现[6]。在工业上广泛使用的磁场絮凝、冷冻絮凝等方法虽然使沉降效率提高[6]，但额外添加的电解质可能干扰样品理化指标的测定结果。目前尚无相应的国家标准以及明确的样品处理方法。

泡菜是生活中最常见的发酵食品之一，利用泡菜进行微生物群落构建研究，从中探索最适发酵微生物配比，筛选具抗氧化活性等功能性菌种逐渐成为生态学、食品学、应用医学等研究领域的新趋势[8-13]。在这些研究中，经常需要掌握泡菜汤中的理化因子变化规律。

当前的泡菜理化指标多局限于pH、酸度、盐度和亚硝酸盐的测定[14-18]，其它指标的测定鲜有报道。由于泡菜汤具有一定粘性，通过激光笔照射具有明显的丁达尔效应[19]，因此泡菜汤具有胶体特性，一般过滤方法不能满足连续流动分析法的需求。胶体的胶粒在电场中的偏移与胶粒所带电荷有关，而胶体凝聚除了可加相反电荷的溶胶外，还可通过加热来实现[3-7]，据此，笔者探究了适用于连续流动分析法的胶体类样品的处理方法，以期为该类样品的精确、快速测定提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

连续流动分析仪：AA3型，德国Seal公司。

实验室纯水系统：Master-S30UVF型，上海和泰仪器有限公司。

电子天平：PX224ZH型，感量为0.1 mg，奥豪斯仪器（常州）有限公司。

恒温振荡器：SHA-B 型，常州澳华仪器有限公司。

超声波清洗机：SB25-12 DTD 型，宁波新芝生物科技股份有限公司。

磺胺、N-1-萘基乙二胺二盐酸、硫酸联氨：优级纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司。

N-1-萘基乙二胺二盐酸盐：分析纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司。

磷酸、聚氧乙烯月桂醚Brij-35、硫酸铜、硫酸锌、四硼酸钠、过硫酸钾、盐酸、焦磷酸钠、硝酸钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

氢氧化钠：优级纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

显色剂A：称取5 g磺胺、0.25 gN-1-萘基乙二胺二盐酸，50 mL 磷酸，用去离子水溶解后，定容至500 mL。

氢氧化钠溶液1：称取10 g 氢氧化钠，3 mL 磷酸，用去离子水稀释定容至1 000 mL，然后加入20%聚氧乙烯月桂醚Brij-35 溶液1 mL，避光保存，每周更新。

硫酸联氨溶液1：加入硫酸铜储备液10 mL（0.001 g/mL)，硫酸锌储备液10 mL（0.01 g/mL)和2 g硫酸联氨，用去离子水稀释到1 000 mL。

润湿剂：取20 mL 20%聚氧乙烯月桂醚溶液Brij-35稀释到100 mL，每月更新。

消解溶液：取14 g 四硼酸钠、3 g 氢氧化钠、7 g过硫酸钾，用去离子水稀释至1 000 mL，每周更新。

显色剂2：取10 g磺胺、0.5 gN-1-萘基乙二胺二盐酸盐和150 mL 盐酸，用去离子水稀释至1 000 mL。

硫酸联氨溶液2：移取2.4 g 硫酸联氨、0.65 mL硫酸铜储备溶液（0.012 g/mL），12 mL硫酸锌储备溶液（0.033 6 g/mL），用去离子水稀释到1 000 mL，每周更新。

氢氧化钠溶液2：取氢氧化钠11.5 g、焦磷酸钠7 g，用去离子水稀释至1 000 mL 后加入2 mL 22%聚氧乙烯月桂醚溶液Brij-35，每2周更新。

硝酸钾标准储备液：ρ(N)=1 000 mg/L，称取7.218 g硝酸钾溶于去离子水中，转移至1 000 mL容量瓶中并定容混匀，盛于试剂瓶中。4 ℃下避光保存，至少稳定6个月。

硝酸钾标准中间溶液：ρ(N)=100 mg/L，量取10.00 mL硝酸钾标准储备液于100 mL容量瓶中，用去离子水定容并混匀，盛于试剂瓶。4 ℃下避光保存，可稳定1个月。

硝酸钾标准使用溶液：ρ(N)=10 mg/L，准确量取10.00 mL硝酸钾标准溶液于100 mL容量瓶中，用去离子水定容并混匀，盛于试剂瓶。4 ℃下避光保存，可稳定7 d。

泡菜汤样品：自制。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

取泡菜汤样品50 mL 于50 mL 离心管中，颠倒多次后，分别取1.5 mL 于1.8 mL 离心管中，以15 000 转速离心10 min，随后取上清液加入另一只离心管中备用，之后按照以下7种方式处理：

（1）取离心后的样品上清液50 μL到5 mL离心管中，加去离子水稀释至100倍体积。

（2）取上清液稀释至100倍体积后，在99%超声强度下超声5 min，使泡菜汁与稀释水进一步混匀。

（3）取上清液在99%超声强度下超声5 min，后稀释至100 倍体积，稀释后样本在99%超声强度下超声5 min。

（4）取稀释后的上清液，置于漩涡震荡仪上震荡5 min。

（5）取上清液液漩涡震荡5 min后，取样品稀释至100倍体积，再次进行漩涡震荡5 min。

（6）取上清液稀释至100倍体积后，将放有样品的离心管在75 ℃ 水浴和超声（99%强度）处理5 min。

（7）取上清液于75 ℃水浴中超声（99%强度）处理5 min 后，取样稀释至100 倍体积，稀释后的样品重复一次超声处理。

上述每个处理组在离心后，后续的具体处理方式都进行5 次重复，（平行取样35 份，每5 份样品采取同一种处理方式，每份样品平行测定3次，总共得到105 个数据），并添加3 杯去离子水样作为空白对照。

1.2.2 样品总氮和硝酸盐/亚硝酸盐含量测定

分别对上述处理后的样品进行总氮和硝酸盐/亚硝酸盐含量测定。

实验流程为：首先检查仪器各原件是否符合测定标准要求，确定符合后再依次打开设备的各组件，检查连接管是否连接好、是否存在漏液现象，待系统稳定后，将试剂管插入相应试剂，待基线稳定设立分析，设定增益后，在进样时间为49 s，清洗时间60 s，测定波长为550 nm 的条件下加入质量浓度分别为5、3.5、2、1.0、0.5、0.1、0.05、0.01 mg/L 的系列硝酸钾标准工作溶液、3 个空白样品及泡菜汤样品进行各指标的测定。

2 结果与讨论

2.1 样品处理方法

在使用连续流动分析仪测定样品时，很容易因为样品的极小差异造成波动，如样品存在微小颗粒、混合不均匀等[1-2]，所以在测定理化指标时需要尽可能的减少平行间的差异。而在使用连续流动分析仪测定泡菜类样品理化指标（总氮、硝酸盐/亚硝酸盐含量）时，通常面临两个主要问题：（1）样品中含有悬浮的不均匀絮状物和颗粒物；（2）理化指标值（样品中总氮、硝酸盐/亚硝酸盐含量）过高，液体具有一定粘稠度，稀释混匀困难。

二者均不利于获得更准确的检测值。

泡菜汤样品具有胶体特性，而胶体一般采用添加电解质絮凝、提高温度的方式处理[3-7]，基于此，采用离心、漩涡震荡、超声、温度等不同操作组合，以便在不添加其它化合物的情况下获取更为均匀的泡菜汤原液，以解决第一个问题。使用去离子水对原始样品进行稀释，通过物理方式协助获取均质稀释液，即可解决第二个问题。

2.2 仪器工作条件的设定

仪器工作条件参照仪器使用说明书（标准曲线判别系数R2=0.999 9）。因为当前缺乏连续流动分析仪测定泡菜样品的国家标准，采用水质测定条件，通过对0.5 mg/L 标准液的总氮和硝酸盐/亚硝酸盐两个指标进行6 次测定，以确定连续流动分析仪在相应工作参数下的准确性和精密度，试验结果见表1。

表1 仪器精密度试验结果

由表1 可知，测定结果平均值与标准值得偏差不超过0.01，6次测定结果较标准值均无显著偏差，满足水质测定要求。

2.3 方法的精密度

使用AA3型连续流动分析仪对7个处理组各5份样品测定值间的相对标准偏差进行计算，试验结果见表2。

表2 方法精密度试验结果

在使用AA3 型连续流动分析仪测定胶体类样本如泡菜汤的理化指标时，仅采用一般的离心和稀释处理方式不能满足测定要求，必须进一步处理才能使测定结果更准确、稳定。

由表2可知，在7个处理方式下测定泡菜汤硝酸盐/亚硝酸盐和总氮时，最佳的是第7 组处理方式，即：样品离心后取上清液，在75 ℃水浴、99%超声强度下处理5 min，稀释处理后重复一次温度超声操作。结果验证，经过热处理，促使胶体聚沉，可以获得更为澄清的上清液，利于后期使用设备进行样品理化指标的测定。据此，加热处理胶体类样品在连续流动分析仪测定中具有较大的开发潜能，未来可在其它理化指标测定中进一步探究。

2.4 样品加标回收试验

对样品按照第7 组方式进行处理，并进行样品加标回收试验，加标泡菜汤样品中总氮、硝酸盐/亚硝酸盐测定结果分别见表3、表4。

表3 加标泡菜汤样品总氮测定结果

表4 加标泡菜汤样品硝酸盐/亚硝酸盐测定结果

由表3、表4 可知，在将样品溶液稀释至100 倍体积后，总氮质量浓度大于1 mg/L 的条件下，加标回收率为97.5%，满足标准要求的加标回收率容许范围[20]。在硝酸盐/亚硝酸盐质量浓度小于1 mg/L的情况下，加标回收率为89.0%，部分样品的加标回收率未达到标准要求[21-22]，可能是胶体样品存在目前尚未发现的影响硝酸盐/亚硝酸盐测定的特性。基于此，建议建立胶体类样品硝酸盐/亚硝酸盐检测方法时，质量控制要求应不同于水质等已有方法中的要求，并加强对胶体类样本特性的研究，以尽快排除其影响，提高该指标的测量准确度。

3 结语

泡菜汤样品离心后取上清液，在75 ℃水浴中99%强度下超声处理5 min，再稀释至100 倍体积，后重复一次上述处理，超声和温度的共同作用可使样品混合均匀，有利于连续流动分析仪对泡菜汤中的硝酸盐/亚硝酸盐和总氮含量进行测定，该方法的精密度和准确性得到验证。这种处理方式简单，易于实现，适用于粘稠度高的溶液或胶体类样本，可在后续试验中继续探讨。同时，在缺乏使用连续流动分析仪测定胶体理化性质的国家标准的情况下，该方法可以为类似的样品处理提供借鉴。