乳液中氢醌的基体标准物质制备

刘彤彤，金绍明，曹进，宁霄

［中国食品药品检定研究院，国家市场监管重点实验室（食品质量与安全），北京 100050］

氢醌（对苯二酚）长期以来被用于美白祛斑类化妆品中，通过抑制酪氨酸酶活性来阻止黑色素生成，是一种有效的美白成分。研究和临床数据证实，氢醌对哺乳动物细胞具有潜在的诱变性[1]，长期过量使用会对皮肤产生刺激性、致敏性甚至致癌[2-3]。

目前氢醌在国内外被归为化妆品禁限用成分，欧盟化妆品法规（EC）No 1223/2009中，氢醌为禁用组分，仅可在染发剂和人造甲中使用，且用量(质量分数)不超过0.3%和0.02%[4]；美国化妆品原料评价委员会（CIR）2015 年对氢醌规定：用于染发剂和人造甲的氢醌使用量(质量分数)不超过1%，不得使用于驻留类化妆品中[5]；我国《化妆品安全技术规范》（2015版）规定：化妆品中禁止使用氢醌[6]。

美白祛斑类化妆品市场规模大且存在产品质量参差不齐、虚假宣传等问题[7-8]，因而对禁用成分氢醌的监测十分必要。由于化妆品基质复杂多样[9]，为避免基质效应影响检测准确度[10]，满足检测过程中质量控制需求，有必要研制相关基体标准物质，但目前市场上未见乳液中氢醌标准物质出售，为填补市场空白，笔者研制出乳液基体中氢醌标准物质，可为化妆品中特别是乳液类美白产品中氢醌的检测提供质量控制，对化妆品基体标准样品的研制流程和方法有一定借鉴作用。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：UltimateTM3000型，美国赛默飞世尔科技有限公司。

电子分析天平：（1）XP 205 型，感量为 0.01 mg；（2）AL 204 型，感量为 0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

超纯水系统：Milli-Q 型，密理博（中国）有限公司。

氢醌标准品：纯度（质量分数）为99.7%，上海安谱实验科技股份有限公司。甲醇：色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司。乳液原料：化妆品乳液（不含氢醌的阴性乳液样品）。

实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

选用市售化妆品乳液作为加工原料（原料为不含氢醌的阴性乳液样品）满足标准物质制备的适用性、代表性原则，及均匀性、稳定性的要求[11]。添加一定量的氢醌标准品，充分混合均匀后，再进行分装（5 g/瓶），于棕色塑料瓶密闭储存，共计500瓶。

1.2.2 样品预处理

称取样品1 g（精确至 0.001 g）于具塞比色管中，用甲醇定容至10 mL，常温超声提取15 min，取上清液，经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为样品溶液。

1.2.3 氢醌标准溶液配制

氢醌标准储备溶液：1 000 mg/L，称取氢醌标准品0.1 g（精确至0.000 1 g）于烧杯中，用少量甲醇溶解后，转移至 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至标线。于4 ℃暗处保存，在一个月内稳定。

氢醌系列标准工作溶液：取适量氢醌标准储备溶液，用甲醇稀释成质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、50、100 mg/L。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：C18柱（150 mm× 3.9 mm，5 μm，赛默飞世尔科技公司）；流动相：甲醇-水（体积比为60∶40），流量为1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：室温；进样体积：5 μL。

1.2.5 样品测定

在1.2.4色谱条件下，取氢醌系列标准工作溶液分别进样，以标准工作溶液质量浓度为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。取样品溶液进样，记录色谱图，测得色谱峰面积，利用标准曲线法得到样品溶液中氢醌的质量。

1.3 样品均匀性和稳定性考察

分别参照 CNAS-GL003：2018 《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[12]、CNAS-GL017：2018《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》[13]、JJF 1343—2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》[14]中关于均匀性、稳定性检验的要求进行统计分析。

1.3.1 均匀性检验

参照JJF 1343—2022中均匀性检验对抽取单元数量和重复测定次数的要求，随机抽取15 个样品，每个样品重复测定2 次，进行均匀性检验。采用单因素方差分析(ANOVA)的F检验进行统计分析。

1.3.2 短期稳定性检验

模拟在40 ℃，湿度80%的运输条件下，以均匀性检验测定结果为初始值（0 天测定值），分别在1、3、7 天取样，每次取3个样品，每个样品测定2次，采用t检验法评价样品的短期稳定性。

1.3.3 长期稳定性检验

在2～8 ℃、避光干燥的保存条件下，按照先密后疏[14]原则，以均匀性检验测定结果为初始值（0 月测定值），分别在1、2、4、6月取样，每次取3个样品，每个样品测定2次，采用t检验法评价样品的长期稳定性。

1.4 定值方法及不确定度评定

标准物质定值参照JJF 1343—2022 和ISO Guide35∶2006[15]，采用一种方法多家实验室联合定值的方式，选择2家具备检验资质的机构，连同本实验室，共计3 家，使用相同方法，对乳液中氢醌含量进行测定。向另外两家实验室分别发放5 个样品，每个样品重复测定2 次，对回收数据使用格拉布斯（Grubbs）检验剔除组内离群值，使用狄克逊（Dixon）法检测各组数据的中位值是否有显著性差异。最终使用各实验室检测结果中位值的中位值作为样品定值结果。

参照GB/T 15000.3—2008[16]，对均匀性、稳定性和指定值带来的不确定度进行定量，并将各来源不确定度进行合成及扩展，得到乳液中氢醌含量的扩展不确定度。

2 结果与讨论

2.1 均匀性检验结果

按照1.3.1方法，从500个样品中随机抽取15个进行均匀性检验，乳液中氢醌质量分数测定结果列于表 1，采用单因素方差分析测定结果，统计结果如表2所示。在α=0.05时，查表得F0.05(14,15)=2.42，由表2可知，乳液中氢醌标准物质的F计算值为1.57，F＜F0.05(14,15)，表明组内和组间无明显差异，乳液中氢醌标准物质的均匀性良好。

2.2 稳定性检验结果

2.2.1 短期稳定性

标准物质短期稳定性的考察主要是模拟在运输过程中高温、高湿条件对乳液中氢醌含量的影响[17]，因此将分装好的样品置于温度40 ℃、湿度80%的恒温恒湿箱中，考察其在7天内的稳定性，按照1.3.2方法考察短期稳定性，乳液基体中氢醌质量分数测定结果见表3。

由表3 可知，均匀性检测结果平均值作为长期稳定性0 天的测定值，与1、3、7 天的测定结果以时间-测定值做线性拟合，置信水平为95%时，斜率P=0.348 9＞0.05，表明在温度40 ℃、湿度80%条件下，乳液中氢醌标准物质在7天内稳定。

2.2.2 长期稳定性

标准物质的长期稳定性主要考察指定储存条件下，标准物质保持特性值在一定限度内的特性[18]。按照1.3.3 方法，考察乳液中氢醌标准物质在2～8 ℃、避光干燥的保存条件下，6个月内的稳定性，结果见表4。

由表4 可知，均匀性检测结果平均值作为长期稳定性0月的测定值，与1、2、4、6月的测定结果以时间-测定值做线性拟合，置信水平为95%时，斜率的P=0.150 2＞0.05，说明在推荐储存条件下，乳液中氢醌标准物质长期稳定性良好。

2.3 协作定值结果及离群值检验

本标准物质采用多家协同定值的方式，由两家业内具备资质的检验机构（机构A和B）和样品制备方（机构C）协作定值，分别向其它两家机构提供5个样品，每个样品重复测定2 次。机构A 和B 对乳液中氢醌的质量分数测定结果见表5，制备方以均匀性检验结果参与定值（测定结果见表1）。

表1 均匀性检验氢醌质量分数测定结果 μg/g

表2 均匀性检验统计结果

表3 短期稳定性检验氢醌质量分数测定结果 μg/g

表4 长期稳定性检验氢醌质量分数测定结果 μg/g

对3 家实验室的测定数据进行筛选，利用格拉布斯（Grubbs）检验剔除组内可疑值，未发现异常值；采用狄克逊（Dixon）法检测各组数据的中位值是否有显著性差异，结果全部通过狄克逊检验，表明各组组间中位值无显著性差异。通过上述分析计算，可保留所有数据，样品定值结果为各实验室检测结果中位值的中位值见表6。

表6 氢醌质量分数定值结果 μg/g

2.4 定值不确定度的计算

对于标准物质来说，其定值结果的不确定度由3部分组成，分别为：标准物质的均匀性引起的不确定度，标准物质的稳定性引起的不确定度以及标准物质的定值过程带来的不确定度。在置信水平为95%，k=2 时，得到乳液中氢醌基体标准物质最终结果，不确定度表达采取只进不舍的原则进行修约，不确定度计算结果见表7。

表7 不确定度的计算结果

2.5 定值结果

经过均匀性检验、短期和长期稳定性检验以及3 家实验室协作定值，最终确定乳液中氢醌含量指定值为(108±9.86) μg/g（k=2）。

3 结语

研制了乳液中氢醌的基体标准物质，该标准物质均匀性、短期和长期稳定性良好，通过3家实验室定值，并对结果进行不确定度评估，最终得到标准值为108 μg/g，扩展不确定度为9.86 μg/g（k=2）。该标准物质符合基体标准物质的要求，可为乳液中氢醌检测结果的质量控制提供保障。