色谱-质谱联用技术分析结血蒿化学成分

西热巴姆，尼珍，色珍，格桑顿珠

(西藏藏医药大学，拉萨 850000)

藏药结血蒿又称普尔芒那保，是菊科植物毛莲蒿的干燥地上部分，味苦，有浓烈香气[1]，有广谱抗菌作用，被广泛用于藏医临床，主治虫病、脑炎、皮肤病、温毒疔毒疮、咽喉病等症，具有清热解毒、消肿消炎、杀虫利湿等功效[2]。此外，现代研究发现毛莲蒿还具有抗氧化、抗肥胖、抗肿瘤和免疫调节活性等多种药用价值[3]。目前其药效成分和作用机制尚不清楚。笔者利用顶空静态加热萃取技术分离提取结合气相色谱-质谱联用技术和超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱法，对结血蒿的化学成分进行全面解析，以期为探究结血蒿作用机制研究和药物的开发利用提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

电子分析天平：CP225D 型，感量为0.01 mg，德国赛多利斯公司。

粉碎机：DFY-1000C 型，温岭市林大机械有限公司。

超声清洗器：KQ-250E 型，昆山市超声仪器有限公司。

恒温混匀仪：MSC-100 型，杭州奥盛仪器有限公司。

漩涡混匀器：MX-S 型，美国赛洛捷克公司。

台式离心机：Heraeus Biofuge Primo R 型，美国赛默飞世尔科技公司。

旋转蒸发器：R-300EL 型，瑞士布奇公司。

气相色谱-质谱联用仪：7694E-6980 N-5975B型，美国安捷伦科技公司。

液相色谱-质谱联用仪：Thermo Fisher Ultimate 3000 型及 Q Exactive 型，配套质谱工作站为Xcalibur 3.0 型，美国赛默飞世尔科技公司。

结血蒿样品：经山东中医药大学刘红燕教授鉴定为毛莲蒿的干燥地上部分，标本存放于山东中医药大学药学院，编号为 2022JXH01。

标准物质：柚皮素、木犀草素、绿原酸、槲皮素、白杨素、阿魏酸、高良姜素、芹菜素、异鼠李素、木犀草苷、橙皮素的质量分数均大于98 %，成都值标化纯生物技术有限公司。

甲醇、甲酸、乙腈：HPLC级，美国赛默飞世尔科技公司。

无水乙醇：分析纯，吉林省新天龙实业股份有限公司。

石油醚：分析纯，上海沪试化工有限公司。

实验用水：蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。

1.2 实验步骤

1.2.1 样品预处理

气相色谱-质谱联用样品：取10 mg结血蒿粉碎放入30 mL钳口顶空进样瓶中备用。

液相色谱-质谱联用样品：取20 mg 结血蒿，加200 mL 甲醇超声60 min，重复3 次得到结血蒿甲醇提取液。蒸干溶剂得浸膏，甲醇复溶至50 mg/mL，过0.22 µm滤膜保存备用。

1.2.2 标准品溶液配制

称取柚皮素、木犀草素、绿原酸、槲皮素、白杨素、阿魏酸、高良姜素、芹菜素、异鼠李素、木犀草苷和橙皮素1 mg，精确至0.01 mg，以甲醇定容，配制成1 mg/mL 单一标准溶液，各单一标准溶液均取100 µL混合，过0.22 µm滤膜保存备用。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 气相色谱-质谱联用仪

进样口温度：250 ℃；柱箱温度：50 ℃，机箱温度（Aux-2 温度）：280 ℃；离子源：EI；扫描模式：全扫描模式；载气：氮气，流量为0.5 mL/min；柱温：初始50 ℃保持3 min，以40 ℃/min 的速度升温到250 ℃，保持3.5 min；进样方式：分流进样，分流比为10：1；溶剂延迟：3 min；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；电子轰击能量：70 eV［4］。

1.3.2 液相色谱-质谱联用仪

色谱柱：ACQUITY UPLC®HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm，美国沃特世科技有限公司）；柱温：35 ℃；流动相：A相为0.05%（质量分数，下同）甲酸-水，B 相为0.05%甲酸-乙腈，流量为0.3 mL/min，梯度洗脱；洗脱程序：0～2.5 min 5% B 相，2.5～4 min 5%～18% B 相，4～18 min 18%～25% B 相，18～21 min 25%～40% B 相，21～29 min 40%～70% B 相，29～32 min 70%～100% B相；扫描模式：全扫/二级质谱扫描（Full MS/dd-MS2）；碰撞能量：20、40、60 eV；扫描范围：m/z100～1 500。

1.4 成分分析与结构鉴定

1.4.1 挥发性成分鉴定

利用NIST11谱库和保留时间、保留指数对所得到的质谱图进行检索定性。

1.4.2 非挥发性成分鉴定

通过UPLC-Q-Orbitrap-MS 对结血蒿甲醇提取物进行正、负模式采集，得到总离子流图。目前对结血蒿非挥发性物质成分的研究较少，检索 TCMSP数据库，并在 Pubmed 及 CNKI 查阅相关的国内外文献，在根据结血蒿的种属、科目，在蒿属、菊科植物等结血蒿亲缘性植物中建立化合物数据库。使用Xcalibur 3.0 软件，根据各成分的元素组成计算精确质量数，结合分子离子、碎片离子信息，分析标准品的质谱裂解规律并比对相关文献报道内容，从而鉴定化学成分。

首先通过一级 MS 确定准分子离子峰，利用Xcalibur 3.0 质谱工作站中的化学式预测功能，预测出化学式；再根据 MS2裂解碎片信息，进行相关基团和母核结构的推导，总结出特征碎片离子；最后参照结血蒿提取物所含成分的质谱裂解规律对结构进行推测和指认。

2 结果与讨论

2.1 气相色谱条件

参照文献[4]色谱条件，结血蒿各组分分离良好。

2.2 液相色谱条件优化

为提高离子响应度和改善峰形，并参考前期文献，选定含0.05%甲酸的水为A 流动相和含0.05%甲酸的乙腈为B流动相[5]。

分别选择梯度洗脱（1）0 ～ 2 min 5% B，2 ～ 4 min 5% ～ 19% B，4 ～ 13 min 19% ～ 40% B，13 ～22.5 min 40% ～ 100% B，22.5 ～ 24 min 100% B；（2）0 ～ 3 min 5% B，3 ～ 4 min 5% ～ 19% B，4 ～ 21 min 19% ～ 45% B，21 ～ 26 min 45% ～ 100% B，26 ～27 min 100% B；（3）0 ～ 2.5 min 5% B，2.5 ～ 4 min 5% ～18% B，4 ～ 18 min 18% ～ 40% B，18 ～ 26 min 40%～80% B，26 ～ 27 min 80% ～ 100% B；（4）0 ～ 2.5 min 5% B，2.5 ～ 4 min 5% ～ 18% B，4 ～ 15 min、18% ～25% B，15 ～ 18 min 25% ～ 40% B，18 ～ 26 min 40%～ 80% B，26 ～ 27 min 80% ～ 100% B 进行预实验。根据总离子流图，在某些时间段出峰少、响应低，适当缩短此段时间；相反，在某些时间段出峰较多、峰形不理想，则适当延长此段时间。最终优化的流动相洗脱梯度见1.3.2。

2.3 基于GC-MS分析的结血蒿挥发性成分鉴定

利用气相色谱-质谱联用技术分析，结血蒿样品的总离子流图如图1。在结血蒿中鉴定到62种挥发性成分，包括19 种醇类、3 种醛类、12 种酯类、酮类等。其中含量较高的成分有2,5-二甲基-3-乙烯基-1,4-己二烯、4-甲基-1-丙-2-基双环[3.1.0]己-2-烯、桧烯、反式-2,7-二甲基-4,6-辛二烯-2-醇、二环[3.1.1]庚-2-烯-4-醇，2,6,6-三甲基乙酸盐、2-甲基六-3,5-二烯-2-醇、2-甲氧基-1,7,7-三甲基双环[2.2.1]庚烷、10-十一烷二烯酸甲酯等，见表1。

表1 结血蒿挥发性成分鉴定结果

表2 结血蒿非挥发性成分鉴定结果

图1 GC-MS分析结血蒿总离子流图

图2 LC-MS分析结血蒿总离子流图

图3 LC-MS分析混合标准品总离子流图

2.4 基于LC-MS分析结果的结血蒿非挥发性成分鉴定

采用 UPLC-Q-Orbitrap-MS 技术分析结血蒿样品溶液和标准品溶液的化学成分，主要鉴定信息见表 2。结血蒿甲醇提取液的总离子流图见图 2。混合标准品溶液的总离子流图见图 3。

2.4.1 氨基酸类成分鉴定

植物中氨基酸具有调节免疫功能和保护、改善神经系统等作用[15]，在结血蒿中共鉴定到精氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸5种氨基酸。

2.4.2 有机酸类成分鉴定

有机酸是存在于生物中的一种含有羧基的酸性有机化合物，具有促消化、抗氧化、改善心血管功能、抑菌消炎等作用[16-17]。在结血蒿中共鉴定到阿魏酸、没食子酸、焦性没食子酸、绿原酸等10种有机酸类化合物。以绿原酸和阿魏酸为例分析结血蒿中有机酸的解列规律。

2.4.3 苯丙素类成分鉴定

苯丙素常见于玄参科和唇形科植物，在一些藏药中也广泛存在[18]。苯丙素具有多种药理活性，包括抗菌消炎、抗病毒、改善心血管功能等[19-20]。结血蒿中共鉴定到香豆素、6-甲基香豆素、茵陈色原酮3种苯丙素类化合物成分。经典香豆素类化合物裂解规律强，可以连续解离[CO]，以化合物17 香豆素为例，母离子m/z147.044 0 连续两次解离[CO]，分别得到m/z119.049 4、91.054 8离子。

2.4.4 黄酮类成分鉴定

黄酮类化合物是以C6—C3—C6为基本碳骨架的化合物，是广泛存在于自然界植物中的次生代谢产物，且存在形式多样。黄酮有抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种生物活性，受到人们的广泛关注[21-23]。在藏药结血蒿中共有异槲皮苷、忍冬苷、木犀草素、槲皮素、柚皮素、橙皮素、芹菜素、异鼠李素等21 种黄酮化合物被鉴定出。黄酮类化合物质谱图有较强的特异性，容易辨认识别，多为RDA 裂解伴随CO2、H2O 的掉落。以柚皮素为例代表黄酮类化合物的裂解规律，母离子m/z271.061 0经DRA 裂解得到m/z151.002 2、107.012 2，m/z151.002 2 离子，在负离子模式下解离CO 得到m/z119.048 6离子。

3 结语

结血蒿作为一味传统藏药，临床应用十分广泛，具有抗菌消炎、抗氧化、改善心血管功能等作用。笔者利用 GC-MS 技术和 UPLC-Q-Orbitrap-MS 技术对结血蒿的挥发性和非挥发性成分进行全面的鉴定，结果表明，结血蒿中主要含有醇、醛、酯、酮等62种挥发性成分和氨基酸、有机酸、苯丙素、黄酮等化学成分共62种非挥发性成分，支持结血蒿发挥各种药理活性。结血蒿的物质基础研究为其进一步的开发利用和质量控制奠定了基础，并为其药理作用的深入研究和药理活性的深入发掘提供科学依据。