不明原因肝病中外泌体的研究进展

汪增秀 赵宏宇 吴卫锋 宋金云

外泌体是一种直径30～150 nm双磷脂膜囊泡,携带着大量的蛋白质、核酸、脂质等多种生物活性成分,存在于各种体液中,包括血液、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、胸腔积液、羊水和腹水等[1]。外泌体作为一种信息交流的媒介,将携带的mRNA、miRNA、蛋白质、脂质等多种组分传递至近邻细胞,通过体内循环系统到达身体其他细胞和组织中,影响靶细胞的生物活性,并可影响多种生理和病理过程[2]。

“不明原因肝病”是指肝功能生化指标反复异常(一般持续6个月以上),或肝脏影像学检查异常,甚至发展为肝硬化等病变,无法通过病史询问、体格检查和血清学检查等常规诊疗手段明确病因。不明原因肝病病因繁多,主要以非感染因素为主,如自身免疫性肝炎(AIH)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、药物性肝损伤(DILI)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)及其他系统疾病累及肝脏等[3]。肝穿刺活组织检查是确认不明原因肝病原因的金标准,但是肝穿刺活检的有创性使得该诊断方法在效率上仍受到限制。大量研究显示,外泌体可能参与了不明原因肝病的发生和发展过程。目前,尿液中的外泌体被认为是非侵入性的分子生物标志物,血液中的外泌体被认为是微创分子生物标志物,有可能代替以往的肝穿刺活组织检查技术,用于不明原因肝病的早期检测和预后。另外,外泌体及其携带组分参与了肝细胞的修复、再生和迁移等生理过程,因此可能是不明原因肝病的潜在治疗手段和治疗靶点。以下简要概述外泌体在不明原因肝病的发生和发展中的作用。

一、泌体形成过程与组成成分

(一)外泌体形成过程 首先在胞吞作用下,细胞膜内陷形成包含细胞表面蛋白与细胞外环境成分(蛋白质、脂质、代谢物、小分子和离子)的杯状结构,早期核内体形成。早期核内体还可以与内质网和反式高尔基体融合,所以一些早期核内体可能包含不同起源的膜和管腔成分。早期核内体成熟,形成晚期核内体。晚期核内体通过二次内陷,形成腔内小囊泡。腔内小囊泡不断累积并逐渐成熟,最终形成包含一定数量和大小不一小囊泡的多泡体。多泡体可以通过细胞骨架和微管网络运输到细胞膜,与细胞膜融合,最终释放出外泌体。另外,多泡体可以与溶酶体或自噬体融合后降解,降解产物可由细胞回收[4]。

(二)外泌体组成成分 外泌体包含不同类型的细胞表面蛋白质、细胞内蛋白质、RNA、DNA、氨基酸和代谢物等成分。四跨膜蛋白家族(CD9、CD81和CD63)、脂筏标记蛋白(flotillin)、凋亡转接基因2互作蛋白X(ALIX)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、神经酰胺是外泌体的标志蛋白质。多种细胞可分泌外泌体,如间充质干细胞(MSC)、肿瘤细胞、人羊膜上皮细胞、内皮细胞、神经元细胞、肥大细胞、巨噬细胞、树突状细胞及T淋巴细胞等[5]。

(三)外泌体功能 外泌体作为细胞间通信的关键介质,能够输送核酸、蛋白质及脂质到靶细胞,在抗原呈递、炎症、血管形成、细胞凋亡等生物过程中发挥作用,从而维持正常生理过程和介导病理过程,包括癌症、感染、神经退行性疾病、代谢性疾病及自身免疫性疾病等[6-10]。

二、外泌体在不明原因肝病中的作用

肝脏是人体新陈代谢的重要器官,参与机体的再生、凝血、免疫、解毒、三大物质代谢、生物转化和内分泌调节、存储等功能。肝脏细胞既可以分泌外泌体,同时也是自身分泌的和其他组织细胞产生的外泌体的作用靶点。以肝脏细胞为靶点的外泌体广泛参与了不明原因肝病的多项生物学进程,与不明原因肝病的发生和发展均有密切联系。

(一)外泌体与AIH AIH是一种由免疫介导的攻击自身健康肝细胞而引起的慢性肝脏实质性炎症,临床特征为血清转氨酶异常升高、自身抗体(主要为抗核抗体、抗平滑肌抗体及抗肝肾微粒体抗体等)阳性、免疫球蛋白和γ球蛋白水平升高。肝组织学特征为肝小叶内,肝细胞存在不同程度的界板炎,以及所谓的“玫瑰花结”样肝细胞变性团。AIH如果不治疗,将可进展为肝硬化和肝衰竭[11]。虽然使用皮质类固醇是AIH的常见治疗方法,但一些AIH患者对皮质类固醇治疗反应严重,一些康复患者在停止使用类固醇后可能会产生严重的不良反应或者疾病复发[12]。因此,需要新的替代疗法用于AIH 的治疗。

由于MSC具有较强的分化能力、低免疫原性和免疫调节功能,常被用于组织修复和炎症性疾病的治疗[13]。有研究发现,MSC通过其分泌的外泌体靶向恢复肝脏稳态,并使肝细胞修复和再生,可能具有治疗肝脏疾病的特性[14]。MiR-223-3p(曾称为MiR-223)是骨间充质干细胞(BMSC)中表达最高的miRNA,可以负向调节许多炎症基因的表达,在自身免疫性疾病中发挥重要作用。在肝抗原S100诱导的小鼠AIH实验模型中,BMSC来源的外泌体作为载体,递送miR-223,可减轻AIH 引起的肝损伤,这可能与外泌体miR-223能够降低NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)及 caspase-1蛋白的表达有关[15]。另一项研究也发现BMSC外泌体能够与miR-223-3p成功结合,并将miR-233-3p输送到巨噬细胞,同时对巨噬细胞无毒性作用。用携带 miR-223-3p 的BMSC外泌体治疗S100/CFA 诱导的AIH小鼠,可以减轻AIH小鼠肝脏的炎症反应及巨噬细胞中的炎性细胞因子释放。其机制可能与 miRNA-223-3p 介导的 STAT3 基因和炎性细胞因子(IL-1β 和 IL-6)表达的调节,以及 Treg/Th17升高有关[16]。在炎症相关细胞中,巨噬细胞在AIH的触发和过程中起主导作用。由于外泌体作为一种具有高生物相容性和低免疫原性的药物载体,而地塞米松(DEX)又是一种强效抗炎药,所以Zhao J等结合外泌体和DEX的优势,构建了携带DEX的外泌体(Exo@DEX)。研究发现,Exo@DEX可以在刀豆蛋白 A诱导的AIH小鼠肝脏中大量累积,有效地内化到巨噬细胞中,并且对巨噬细胞具有显著的抑制作用,进而对刀豆蛋白A诱导的AIH小鼠肝脏具有有效的保护作用。该研究发现,与传统的DEX治疗相比,MSC衍生的外泌体作为DEX载体给药,对AIH具有更好的治疗效果[17]。这些研究结果表明,外泌体可能为AIH的治疗提供一定的方向和依据。

(二)外泌体在PBC和PSC中的作用 PBC以前称为原发性胆汁性肝硬化,是一种以肝内中小胆管的非化脓性进行性破坏性损伤为特征的慢性肝内胆汁淤积性疾病,最终可发展至肝硬化。PBC多见于中老年女性,其发病机制可能与遗传、环境及免疫等因素有关。抗线粒体抗体是PBC的特异性标志物,且PBC最典型的临床症状为乏力、瘙痒、黄疸及消化不良[18]。PSC也是一种慢性胆汁淤积性病变的自身免疫性肝病,其主要特征为特发性肝内外胆管炎症和纤维化,进而导致多灶性胆管狭窄,最终可发展为肝硬化和肝衰竭。PSC多见于中青年男性,主要症状表现为乏力、瘙痒、骨质疏松和脂溶性维生素缺乏等,其病因可能与感染、肠毒素吸收、遗传、免疫及胆管缺血等因素有关[19]。研究发现,从PBC患者血浆中分离出的外泌体虽然不会改变细胞因子的产生,但它们确实显著改变抗原呈递细胞上的共刺激分子表达,如CD14+单核细胞上的CD86表达上调,以及CD11c+树突状细胞的CD40表达上调。这些共刺激分子在调节T细胞活化中发挥不同的作用,可能参与PBC的发病机制[20]。Liu R等研究发现,PBC、PSC患者的血清外泌体H19水平显著上调,通过real-time PCR、western blot、组织学和免疫组织化学分析小鼠和人PSC/ PBC肝脏样本,发现肝H19水平与肝纤维化的严重程度密切相关。肝星状细胞(HSC)在胆汁淤积性肝病进展中起着关键作用,体外实验发现富含H19的外泌体能够增强小鼠原代HSC的转分化,并促进HSC衍生的成纤维细胞的增殖。体内实验表明在胆汁淤积条件下,胆管细胞来源的富含H19的外泌体快速且优先被HSC及HSC衍生的成纤维细胞吸收,然后通过上调成纤维细胞的纤维化基因表达,从而促进肝纤维化。这项研究表明,胆管细胞源性外泌体H19可以作为胆汁淤积性肝纤维化的潜在诊断标志物和治疗靶点[21]。胆管细胞衰老是PBC和PSC的重要病理过程。Chen W等将氧化应激刺激的胆管细胞类器官与人胎盘间充质干细胞(hPMSC)衍生的外泌体共培养,使用免疫组织化学、免疫荧光染色及ELISA等试验分析,发现hPMSC衍生的外泌体治疗可延缓胆管样衰老进程并降低SASP成分和趋化因子的表达,如CCL2、CX3CL1、IL-6、TNF-a、CXCL1和CXCL10,表明hPMSC衍生的外泌体可能对PSC或PBC具有治疗潜力[22]。这些研究结果表明,外泌体既可以作为PSC或PBC微创分子生物标志物,也可能是PSC或PBC的潜在治疗靶点。

(三)外泌体与DILI DILI是指由药物本身,如化学药物、传统中药、保健品等,及其中间代谢产物所诱发的肝损害[23]。由于DILI无特异的临床表现,诊断困难,多通过测定患者肝功能指标、常规影像学检查及肝活检来辅助诊断。近年来,一些研究认为外泌体可能作为潜在分子生物标记物,用于DILI的早期检测、监测和评估。乙酰氨基酚(APAP)引起的急性肝衰竭是DILI和死亡的主要原因。在APAP-DILI的SD大鼠中,循环miR-122的数量增加,并且miR-122主要存在于外泌体中。此外,当人原代肝细胞暴露于10mM APAP 24 h后,外泌体中miR-122的水平明显增加[24]。在另一项研究中,APAP给药能显著提高外泌体中miR-122、miR-192和miR-155的表达量,这三种外泌体miRNA可以反映肝细胞损伤情况[25]。Zheng等对苦楝水提取物(FMT)暴露的小鼠血清循环外泌体中的miRNA进行差异表达分析,发现外泌体miR-370-3p是变化最显著的miRNA。外泌体miR-370-3p通过升高p21和细胞周期蛋白E,从而加重中药的细胞毒性作用,提示外泌体miRNA参与了中药肝损伤的发病机制[26]。这些研究表明,外泌体中miRNA可以作为诊断DILI的生物标记物。除了miRNA,血液中外泌体mRNA,如白蛋白(Alb)、纤维蛋白原Bβ-多肽(Fgb)、结合珠蛋白(Hp)和β-肌动蛋白(Actb),鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白),β多肽2样蛋白1(Gnb2l)和血浆视黄醇结合蛋白4(Rbp4)等均可作为DILI的生物标记物[27,28]。在DILI小鼠模型中,APAP治疗影响了138种外泌体蛋白的丰度,如CES1、ADH1、GST、APOA1、ALB、HP和FGB蛋白,外泌体蛋白的表达水平与APAP剂量和暴露时间有关。这些研究表明血液中除了外泌体miRNA和mRNA外,外泌体蛋白也可以作为DILI的敏感生物标记物[29]。此外,研究还发现,来源于 MSC和肝细胞的外泌体能够促进肝脏再生,调节炎症反应,减少肝细胞凋亡,可以作为DILI的潜在治疗药物和靶点[30]。Tan CY等通过不同的给药途径将外泌体与CCl4同时引入小鼠模型,发现MSC衍生的外泌体通过促进肝细胞的增殖,增加细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E的表达,逆转CCl4诱导的损伤。体内研究表明,在APAP和H2O2引起的损伤后,MSC来源的外泌体可以通过上调 Bcl- xL 抑制 APAP诱导的肝细胞凋亡蛋白表达,通过激活增殖和再生反应来引发针对毒物诱导的损伤的肝保护作用[31]。大多数药物诱导的肝损伤是由肝脏的适应性免疫攻击引起的。Holman NS等通过聚合物沉淀法从原代人肝细胞的条件培养基中分离出外泌体,然后用肝细胞来源的外泌体(HDE)处理THP-1单核细胞,并用LPS刺激,发现HDE能够导致LPS诱导的IL-1β 和IL-8水平显著降低。另外,通过差异表达基因发现,HDE导致72个转录本减少,其中许多转录本涉及免疫功能。在这些差异表达基因中第二丰富的信号通路是“先天免疫细胞和适应性免疫细胞之间的通信”,表明先天免疫细胞(如单核细胞)内的变化可能影响适应性免疫反应。这些数据表明,在DILI中,HDE能够被单核细胞吸收并传递功能性miRNA,这些调节性miRNA和其他外泌体内容物靶向多种免疫介导的转录物,并抑制LPS刺激的细胞因子释放,从而促进肝脏的免疫耐受[32]。

(四)外泌体与NAFLD NAFLD是指排除饮酒史或酒精摄入过多、病毒性肝炎、自身免疫性肝病、药物性肝损伤等所导致的肝脏疾病,其主要病理特征为肝细胞的脂肪蓄积和大泡性脂肪变。NAFLD包括单纯性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 到肝硬化及肝癌的一组疾病[33]。外泌体对脂质代谢具有显著影响,包括脂质的合成、运输和降解[34]。将带有miR-199a-5p的外泌体递送到高脂饮食诱导的脂肪变性模型小鼠中,发现小鼠肝细胞中的脂质积聚加重,同时伴有肝哺乳动物不育系 20 样激酶 1(MST1)表达的下调,最终加剧肝细胞中脂质的积累[35]。AMPKα1是调节白色脂肪组织中外泌体合成、组成成分和脱落的关键分子。Yan C 等发现AMPKα1基因敲除增加了来源于脂肪细胞的外泌体的脱落,并促进了CD36在外泌体中的积累,然后含CD36的外泌体被肝细胞内吞,诱导脂质积聚和炎症。另外高脂饮食可减弱脂肪细胞中的AMPKα1,从而诱导外泌体分泌,增强了白色脂肪组织与肝脏之间的通信,促使了NAFLD的发生[36]。在NAFLD患者的血清中 miR-192-5p 水平与疾病进展呈正相关,且M1巨噬细胞(CD11b+/CD86+)激活是 NAFLD 进展中的重要过程。Liu XL等发现在高脂、高胆固醇饮食喂养的大鼠中,血清miR-192-5p水平、M1巨噬细胞数量及肝脏促炎因子的表达水平与疾病进展相关。脂毒性肝细胞分泌富含miR-192-5p的外泌体,该外泌体能够促进M1巨噬细胞活化,增加诱导型一氧化氮合酶、IL-6和TNF-α的表达。另外,肝细胞源性的外泌体miR-192-5p抑制雷帕霉素不敏感伴随物(Rictor)的表达,进一步抑制Akt和叉头盒转录因子O1(FoxO1)的磷酸化水平,导致FOXO1的激活,最终诱导炎症反应,从而推动NAFLD的进展,表明血清外泌体miR-192-5p可以作为NAFLD的潜在无创生物标志物和治疗靶点[37]。脂肪毒性和巨噬细胞介导的炎症在NASH的发病机制中起关键作用。Zhao Z等使用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)和甲基-β-环糊精(MβCD)胆固醇处理Huh7细胞,发现胆固醇减少了溶酶体的数量,抑制多泡体在溶酶体的降解,促进Huh7细胞释放含有miR-122-5p的外泌体。外泌体miR-122-5p诱导巨噬细胞M1极化及相关炎症,促进了NASH的发生与发展[38]。内质网(ER)参与调节脂代谢稳态,ER应激引起脂质代谢功能障碍,导致肥胖诱导的肝脂肪变性进展为NASH。Gu H等利用重组慢病毒载体基因沉默方法和基于LC-MS/MS的蛋白质组学和脂质组学,发现ER应激诱导的脂肪细胞分泌外泌体(ATEx)能够协调肝脏中的脂质动态变化。ATEx通过向肝细胞递送外泌体醛酮还原酶1b7(Akr1b7)并升高甘油水平触发NASH的发生[39]。IL-6诱导巨噬细胞和中性粒细胞(尽管程度较小)释放富含miR-223的外泌体,然后外泌体miR-223转移到肝细胞,抑制具有PDZ结合序列的转录共活化因子(TAZ)、Nlrp3、C-X-C基序趋化因子10(Cxcl10)及胰岛素样生长因子1受体(Igf1r)的表达,这几种miR-223靶向促纤维化基因具有促进NASH纤维化作用,从而为NAFLD的治疗提供了新思路[40]。这些研究都表明,外泌体作为细胞间信息交流载体,推动了NAFLD进展,临床上可将其作为NAFLD治疗中的重要靶点。

三、展望

基于目前研究,外泌体携带miRNA、mRNA、lncRNA、DNA、蛋白质、脂质等多种物质,在肝内进行细胞间通信,转运各种信号分子,是细胞之间进行生命活性物质交换的重要载体。外泌体因其具有运输性质、循环能力及优异的生物相容性,可作为一种理想的药物载体,递送多种药物、蛋白质、核酸和基因治疗剂,以提高靶向准确性,同时降低最小剂量和不良反应,为疾病诊断和治疗创新提供新的机遇。虽然国内外学者已经对外泌体的靶向给药、分子标志物及发病机制等方面进行了研究,但是外泌体的临床应用外尚未展开,故外泌体在不明原因肝病中的发展空间巨大。随着研究的进一步深入,外泌体将会为不明原因肝病的预防、诊断、治疗提供新的方法和策略。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。