靶向cccDNA以实现慢性乙型肝炎治愈

梁红妍 申笙 孙剑

一、乙型肝炎感染现状

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的重要公共问题。据WHO报道,全球约有2.96亿慢性HBV感染者[1],而我国约有8 600万例,其中有慢性乙型肝炎(CHB)患者约2 800万例,每年因肝硬化、肝衰竭、肝癌等乙型肝炎相关疾病死亡的人数约为30万[2]。CHB患者接受现有的一线抗病毒药物治疗,如核苷(酸)类似物(NAs)或干扰素(IFN),可有效抑制HBV复制,延缓肝脏疾病进展,减少肝硬化和HCC的发生,从而改善患者预后[3]。然而,现有的抗病毒治疗方案并不能清除HBV感染而达到完全治愈,其根本原因是肝细胞核内持续存在的HBV基因组共价闭合环状DNA(cccDNA)。

二、乙型肝炎治愈的关键

cccDNA可通过细胞外循环及细胞内循环进行补充,并以微染色体形式长期稳定存在于肝细胞核内,它是HBV病毒复制和转录的模板,不易被清除。因此,能否清除cccDNA是慢性乙型肝炎患者能否实现乙型肝炎治愈的关键[4]。目前,关于乙型肝炎治愈,其一是指乙型肝炎的临床治愈,又称功能性治愈,是指停止治疗后HBsAg持续阴性,伴或不伴抗-HBs出现,HBV DNA低于最低检测下限,肝脏生物化学指标正常,肝细胞核内可能仍存在cccDNA。其二,指乙型肝炎的完全治愈,又称病毒学治愈,是指停止治疗后HBsAg持续阴性,伴或不伴抗-HBs出现,HBV DNA低于最低检测下限,肝脏生物化学指标正常,同时肝细胞核内的cccDNA被清除[3]。临床治愈和完全治愈最为重要的区别是cccDNA是否被清除。

三、cccDNA的生命周期

HBV属于嗜肝DNA病毒,其内含约3.2 kb大小的松弛环状双链DNA(rcDNA)。HBV病毒颗粒通过结合肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸共转运多肽受体(NTCP)侵入肝细胞[5],随后其基因组rcDNA被转运入细胞核,并通过一系列环节被修复成cccDNA,具体包括:(1)在宿主因子作用下去除rcDNA负链5′端共价结合的病毒聚合酶Pol以及5’-flap;(2)去除rcDNA正链5′端的RNA引物;(3)在宿主聚合酶及修复因子的作用下,完成rcDNA正链的修复;(4)连接正负链,并进一步折叠、扭曲形成超螺旋结构的cccDNA;(5)cccDNA与组蛋白、非组蛋白等结合,形成微染色体样结构[6]。cccDNA可由病毒颗粒经上述所谓的从头合成途径,也可经rcDNA胞内复制的回补途径形成,并在感染肝细胞核内蓄积为cccDNA池,导致HBV感染慢性化。

Wei等利用酵母细胞系统,发现宿主细胞的五种修复因子:增殖细胞核抗原(PCNA)、复制因子C(RFC)复合物、DNA聚合酶δ(POLδ)、瓣状结构特异性内切酶1(FEN-1)和DNA连接酶1(LIG1),可在体外将HBV rcDNA修复为cccDNA[7],并进一步发现rcDNA正、负链的修复是相互独立的,其中正链的修复需要这五种修复因子的参与,而负链的修复只需要FEN-1和LIG1[8]。

四、清除cccDNA的策略

为实现乙型肝炎的临床治愈甚至完全治愈,cccDNA的清除是科学家们致力攻克的难题。总结近年来关于HBV cccDNA的研究进展,我们认为cccDNA的清除有可能通过以下几个方面实现。

(一)直接靶向cccDNA 持续和稳定存在的cccDNA是造成HBV感染慢性化的关键因素。因此,直接靶向cccDNA显然是一个非常具有吸引力的治疗策略,但该研究策略有赖于对cccDNA形成机制的充分认识和了解。目前已发表的研究表明,多种小分子抑制剂通过靶向参与cccDNA形成过程的宿主修复因子能有效减少cccDNA,包括DNA聚合酶α和δ抑制剂(aphidicolin)、FEN-1核酸内切酶抑制剂PTPD、拓扑异构酶抑制剂、DNA连接酶抑制剂以及DNA检查点激酶ATR和CHK1抑制剂[9]。然而,上述通过靶向宿主DNA修复途径治疗慢性HBV感染的方法是否安全和具有可行性,仍需要进一步研究。此外,基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术,可以准确有效地靶向HBV基因组,抑制病毒基因表达,显著抑制HBV复制,从而减少cccDNA的形成[10]。然而,基因编辑技术可能存在的脱靶效应、缺乏合适的体内递送载体,以及是否会影响宿主基因组或线粒体DNA等,仍是需要解决的未知挑战。

Wang等[11]通过在HBV感染的人原代肝细胞和HepDES19细胞中进行高通量筛选,发现了一种可降低cccDNA水平的小分子化合物ccc_R08,并在环状HBV(HBV circle)小鼠模型及人肝嵌合小鼠模型中进行了验证。 该研究结果显示,ccc_R08可降低小鼠血清中的HBsAg、HBeAg、HBV DNA、pgRNA及肝细胞中的cccDNA水平,这是首次发现有小分子可作用于已建立的cccDNA库,为彻底治愈CHB患者提供了一种新的途径。

(二)通过表观调控机制抑制cccDNA转录 cccDNA作为病毒转录复制的模板,通过与组蛋白和非组蛋白等结合形成微染色体结构。既往研究表明,cccDNA的组蛋白修饰是调控其转录的重要方式,而其中组蛋白甲基化和乙酰化是目前研究较为明确的能调控cccDNA转录活性的修饰方式。参与表观遗传修饰的宿主因子,如蛋白甲基转移酶SETDB1、PRMT1、PRMT5等,可通过调控cccDNA组蛋白甲基化水平影响cccDNA转录功能;而组蛋白乙酰基转移酶如p300、CBP、HAT1等,以及组蛋白去乙酰化酶如HDAC1、HDAC11等,则通过调控cccDNA组蛋白乙酰化水平影响cccDNA转录活性[6, 12-13]。此外,有研究发现,代谢物如中草药提取物姜黄素可通过下调cccDNA组蛋白乙酰化水平进而抑制HBV复制[14]。

同时,cccDNA转录也受到其他宿主因子和病毒蛋白的调控。例如近期研究发现,HBx可以通过与宿主因子DDB1相互作用,从而劫持宿主泛素连接酶CUL4A/B,通过泛素化降解SMC5/6复合物,解除SMC5/6对cccDNA转录的抑制作用,进而促进HBV复制[15]。因此,HBx蛋白是抗病毒药物研发的一个重要靶点。Cheng等基于HiBiT-tagged HBx蛋白检测系统,成功筛选出靶向HBx的小分子化合物双香豆素。该研究在HBV感染的细胞模型和人源化肝脏小鼠模型中证明,双香豆素可显著促进HBx蛋白降解,进而显著抑制HBV cccDNA的转录。进一步机制研究发现,双香豆素是细胞NQO1的抑制剂,能解除NQO1对HBx蛋白的保护作用,从而促进HBx蛋白经泛素非依赖的20S蛋白酶体途径降解。该研究极大地鼓舞了靶向HBx蛋白的新型抗HBV药物的开发[16]。

(三)耗竭cccDNA池 目前的一线抗病毒药物NAs,其作用机制是竞争性抑制HBV DNA聚合酶的活性,从而显著抑制rcDNA的合成,以阻断cccDNA的合成,理论上有耗竭cccDNA池的可能[3]。

cDNA主要在核衣壳中逆转录合成,而包裹rcDNA的核衣壳是cccDNA胞内外循环补充的唯一来源。因此,抑制病毒核衣壳组装,可以抑制rcDNA的形成,从而减少cccDNA的补充,是目前抗HBV药物研发的新靶点。HBV核衣壳抑制剂与HBV的核心蛋白结合,可导致所形成的病毒衣壳的构象发生改变,具体可分为两类:一类是促进核衣壳的降解,从而形成非衣壳的核心蛋白聚合物,主要包括GLS4、RO7049389等;另一类是促进形成形态正常而缺乏病毒核酸的空心核衣壳,主要包括ABI-H0731、JNJ6379等[17]。

我们团队最近的一项研究结果显示,通过测定抗病毒治疗过程中患者血清HBV RNA耐药突变LAMR(rtM204V),可动态反映肝内cccDNA池的更新速度,并颠覆性地发现肝内cccDNA更新周期约5.6～11.1周[18],远快于之前估计的数十年[19]。这一结论提示有可能通过联合治疗的手段,彻底阻断cccDNA的补充,从而耗竭肝内cccDNA池以实现cccDNA清除。

(四)免疫调节清除cccDNA HBV持续感染与CHB患者体内天然免疫和适应性免疫的功能缺陷密切相关。一线抗病毒药物IFNα可诱导免疫调节,激活先天免疫和特异性免疫,以发挥抗病毒作用。而近年来,聚焦于CHB的免疫治疗研究日益增多,其中,天然免疫的Toll样受体(TLR)激动剂、适应性免疫的细胞治疗,以及重建免疫的治疗性疫苗等的主要目的均是提高免疫系统的抗病毒作用[20]。然而,上述的免疫治疗策略,是否能清除cccDNA,仍有待进一步研究。

目前,HBV cccDNA的研究仍面临许多困难和挑战,包括:(1)cccDNA在体内的合成机制仍未完全阐明;(2)cccDNA的转录调控机制仍未完全阐明;(3)现有的乙型肝炎血清标志物不能完全准确反映肝内cccDNA的活性状态;(4)目前仍缺乏理想的研究cccDNA的细胞和动物模型等。相信随着研究的深入,上述困难和挑战将被克服,乙型肝炎终将被治愈。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。