丹酚酸B 对去卵巢骨质疏松小鼠的生物学变化及机制

岑美婷

广州市第一人民医院（广东广州 510180）

骨质疏松症是骨病中最常见的一种，表现为骨矿质密度低，骨微结构退化，从而引起骨脆性骨折［1］。目前，骨质疏松症的治疗药物主要为包括双磷酸盐、降钙素和选择性雌激素受体调节剂在内的骨吸收抑制剂［2］。虽然这些药物对骨量起到有效的稳定作用，却不会使骨形成增加。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种很容易从骨髓等组织中分离出来的是非造血细胞［3］。MSCs具有多种能力分化成其他细胞类型，包括骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和神经元［4］。近年来，在促进骨折、节段性骨缺损等愈合方面，一直在使用MSCs，而且成绩喜人。研究者已经发现将 MSCs 引导至骨骼可以促进骨形成并增加骨量［5］。在骨质疏松症患者中，研究显示MSCs成骨分化潜力降低，因此，寻找有效的方法来促进MSCs成骨分化显得刻不容缓。

中药丹参的主要生物活性成分丹酚酸B（salvianolic acid B，SalB）被广泛应用于心血管疾病的治疗［6］。研究显示，SalB具有保护神经的功能，同时也能缓解肝脏纤维化［7-8］。最近的研究表明SalB可以预防骨质疏松症的发展［9］。丹参联合MSCs治疗股骨头缺血性坏死可能通过增加股骨头中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白-2的表达促进血运重建，促进骨化和血运重建［10］。丹参能在缺血条件下增强MSCs的存活，可通过促进MSCs的存活来增强对脑缺血性中风的治疗效果［11］。在本研究中，探讨了丹酚酸B对去卵巢骨质疏松小鼠的影响以及对小鼠MSCs成骨分化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 从广东省医学实验动物中心购进8周龄18只体质量20～25 g的无特定病原体（specefic pathogen free，SPF）级雌性C57小鼠，许可证号SYXK（粤）2022～0002。饲养条件：温度24 ℃，相对湿度45%。每天照明12 h的光照，标准饲料，自由饮水、摄食。每周更换消毒过的垫料、笼具1次。

1.1.2 药物 SalB是由四川省维克奇生物科技有限公司采购的。使用生理盐水将其完全溶解后，腹腔注射进小鼠体内。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及干预方法 将18只小鼠分为3组：假手术组、骨质疏松组、SalB治疗组，各6只。双侧卵巢摘除术后连续3天进行抗感染治疗。术后4周，每2天注射1次，持续12周的SalB 2.5 mg/kg腹腔内注射SalB治疗组，另2组按同样计量的生理盐水腹腔注射，疗程相同。

1.2.2 建立骨质疏松模型 手术前8小时对小鼠实施例行禁食，手术前4小时对小鼠实施禁食。把剪刀、镊子、缝合线、持针器、消毒纱布、酒精棉球、碘伏等一系列的手术器械都消毒好，然后晾干，待用。对小鼠进行常规麻醉后，先用酒精棉球浸湿后背部的毛发，再用刮毛刀清除手术视野周围的毛发，让手术视野完全暴露出来，再以双侧卵巢摘除术复制绝经后骨质疏松症模型。假手术组把卵巢周围的一些脂肪组织经过同样的切口切除。在无菌的情况下进行手术，并严格遵循了实验动物的伦理学原则。

1.2.3 骨密度检测 给药结束后，将所有小鼠在麻醉状态下处死，并取出它们的右侧股骨，测定它们的骨密度。利用Skyscan1172微型CT扫描系统对小鼠的右侧股骨进行了骨密度的检查。

1.2.4 qRT-PCR 冲出骨髓MSCs后加入TRIzol裂解液，并按说明书操作提取总RNA。反转录得到cDNA后，PCR反应依照SYBR Primix EX Taq TMII试剂盒中所提供的操作说明来进行。采用2-△Ct方法，以Gapdh为内参，计算mRNA的相对表达量。

1.2.5 WB实验 骨组织经液氮研磨匀浆后提取蛋白质进行WB实验。使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。接下来进行SDS－PAGE电泳、转膜、封闭与杂交等一系列操作。最后进行化学发光与显影，将胶片进行扫描或拍照，利用凝胶图像处理系统对目标带的分子量和净光密度值进行分析。

1.3 主要观察指标

1）小鼠右后股骨的骨密度；

2）小鼠骨髓MSCs的Runx2 和 Osterix水平；

3）骨组织核因子-κB 配体受体激活剂（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）和骨保护素（osteoprotegerin，OPG）蛋白水平。

1.4 统计学分析

所有结果均采用SPSS 26.0统计软件处理分析，并对3组间的样本均数进行单因素方差分析（One-way ANOVA），以（±s）表示，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠右后股骨的骨密度

Skyscan1172微型CT扫描系统扫描小鼠右侧股骨测定骨密度， 骨质疏松组骨密度为（0.481±0.017）mg/cm3，低于假手术组骨密度（0.571±0.012）mg/cm3（P=0.001 5）。而SalB治疗组骨密度为（0.534±0.008）mg/cm3，高于骨质疏松组（P=0.007 3），见图1。

图1 各组小鼠股骨骨密度比较

2.2 小鼠骨髓MSCs的Runx2和Osterix水平

经RT-qPCR检测发现，各组Runx2 和 Osterix水平均表现为：假手术组＞SalB治疗组＞骨质疏松组。见图2。（在Runx2 mRNA中，假手术组vs骨质疏松组，P=0.002 7；骨质疏松组vsSalB组，P=0.013 2＜0.05。在Osterix mRNA中，假手术组vs骨质疏松组，P=0.001 3＜0.05；骨质疏松组vsSalB组，P=0.002 7。）

图2 各组Runx2 和Osterix 水平比较

2.3 骨组织OPG和RANKL蛋白水平

经WB实验发现，骨组织OPG和RANKL蛋白水平均表现为：骨质疏松组＜SalB治疗组＜假手术组。见图3。

图3 各组OPG 和RANKL 蛋白水平

3 讨 论

年龄的增长会导致骨髓中的MSCs数量下降，进而导致骨质破坏。骨质疏松是一种发病率不断上升的慢性病，处于更年期的妇女更容易发生骨质疏松［12-13］。更年期是老化的一种自然构成，其中包括卵巢的生殖功能下降［14］。可采用手术切除卵巢，也可以采用医源性切除的方法，如化学治疗和放射治疗等。因此，该研究利用小鼠的卵巢摘除后，来探讨更年期后的骨质疏松问题。已知，卵巢切除术后会引起骨质疏松症，骨密度、生物力学强度、骨质量和骨小梁微结构明显下降，上述变化与雌激素缺乏有关［15］。这种方法的优势是可重复，可获得较高的成功率。有研究显示，在小鼠去卵巢后，骨小梁的数量显著降低，骨质稀疏。与此同时，与正常小鼠相比，破骨细胞的数量要多。此外，与正常小鼠相比，它的破骨功能也变得更加活跃［16-17］。

骨骼是一种紧密的结缔组织，包括大约 80%的皮质骨和约 20% 的小梁骨［18］。骨骼会经过不断地重塑，通过重新吸收旧骨，并在同一位置形成相同数量的新骨［19-20］。骨矿物质密度已被看作是骨强度的替代指标，也是骨质量的重要因素。骨质疏松症是因为骨量减少，骨微结构退化，它会提高骨脆性，还会提高髋骨和脊椎骨折的易感性，所以与骨折风险提高相关［21］。

根据报道，Runx2与Osterix是前成骨细胞的成骨细胞分化和成熟的关键基因［22-23］。由于骨的形成依赖于成骨细胞的分化，Runx2和Osterix的表达被认为是骨骼发育的成骨转录因子［24］。Runt相关的转录因子称为Runx因子，其蛋白质在基因启动子调控复合物的形成过程中，位于整合细胞信号的亚核区内。在骨骼发育的胚胎发生过程中，Runx2是人类Runt相关转录因子家族的一员。它被公认具有致癌的特性，许多研究显示Runx2功能的紊乱会引起不同肿瘤的进展和侵袭［25］。长期以来，Osterix（Osx）是调控成骨细胞分化及骨矿化的关键转录因子。有研究显示，Osx不仅在膜内成骨过程中发挥着关键的作用，同时也可以在软骨的最终分化过程中对软骨内成骨产生影响［26］。

骨重塑是由成骨细胞和破骨细胞交互作用调控的［27］。近年来，由于核因子-κB 受体激活剂（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）、RANKL和OPG对骨重建的影响，人们对它们的认识越来越多［28］。RANK 是肿瘤坏死因子家族中的一员，主要表达于破骨细胞或其前体。RANK与其配体RANKL相互作用并通过控制破骨细胞的分化、增殖和总体存活，从而调控骨吸收［29］。据报道，SalB可以增强OPG的表达，从而增加了 MSCs的成骨分化［30］。同时，SalB通过调节 RANKL/RANK/OPG信号通路来改善泼尼松所导致的类风湿性关节炎大鼠的骨质减少症并改善骨质量［9］。本实验的结果显示，与骨质疏松组相比，SalB 治疗后OPG及RANKL蛋白的表达均增加。

丹参属于中草药，其药理功效丰富。SalB是丹参中含量最高、活性最高的亲水性组分之一。前期研究发现，SalB 具有抗氧化、抗炎和抗纤维化作用，还可抑制细胞凋亡［31］。同时，SalB可通过激活ERK通路，增强人体内充质干细胞的成骨能力［32］。此外，SalB可经Wnt/β-Catenin通路，增强人牙周膜细胞的成骨分化［33］。本实验发现，SalB处理后，小鼠的骨密度明显高于骨质疏松组，而Runx2和Osterix mRNA的表达也明显高于比骨质疏松组。

综上所述，丹参对小鼠的骨质疏松具有一定的影响，但还需要更多的实验来验证本研究的结论。