CAR-T 细胞治疗实体瘤的现状研究

彭 倩 吕 琳

广州市第一人民医院（华南理工大学附属第二医院）肿瘤科（广东广州 510180）

1 前 言

恶性肿瘤是严重威胁我国居民健康的重大疾病之一，据统计2020年中国肿瘤死亡病例数300万例，占全球肿瘤死亡人数的30%，排名前五的癌症类型分别为肺癌、肝癌、胃癌、食道癌和结直肠癌［1］。由此可见，恶性肿瘤在中国乃至全世界仍然是一个亟待解决的社会公共卫生问题。近年来，随着医学研究的不断深入，肿瘤治疗已不止局限于传统的化疗、放疗和手术治疗，免疫疗法、纳米疗法、干细胞治疗和基因疗法为临床肿瘤治疗提供了新思路、新方法。嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）细胞疗法作为恶性肿瘤免疫治疗最有希望的进展之一，在血液肿瘤领域取得了令人鼓舞的疗效，受到国内外研究人员的广泛关注［2］。

CAR-T细胞疗法通过基因工程技术来改造T细胞，使其获得识别肿瘤细胞的能力，从而特异性地杀伤肿瘤细胞。2017年8月，第一个CAR-T细胞疗法Tisagenlecleucel（Kymriah）被美国食品药品监督管理局批准用于治疗B前体急性淋巴细胞白血病（B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia，BCP-ALL）；同年10月，第二个 CAR-T细胞疗法Axicabtagene ciloleucel（Yescarta）被批准用于治疗成人弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）［3］。至此，全球范围内掀起了对不同血液系统肿瘤和实体瘤的研究活动，以评估CAR-T治疗在这些疾病中的安全性和有效性。多个临床实验显示，CD19特异性的 CAR-T细胞在治疗B细胞淋巴瘤中取得了令人振奋的成绩，其完全缓解率（complete remission，CR）可达70%～94%。靶向CD20的CAR-T细胞在难治性或复发性 B 细胞淋巴瘤治疗中也被证实了具有可行性和有效性［4-5］。截止2022年12月，FDA已经批准了6款CAR-T细胞产品上市，国家药品监督管理局也分别于2021年6月和9月先后批准了两款 CAR-T产品上市，预示 CAR-T 治疗时代的到来。可以说，CAR-T细胞疗法的出现，为恶性肿瘤治疗提供了一条全新的治疗途径，具有革命性的意义。然而，由于实体瘤的异质性及其周围所存在的特殊肿瘤微环境，用CAR-T细胞治疗实体瘤仍面临着诸多挑战。

本文将系统介绍 CAR-T 疗法在实体瘤中的最新研究进展，包括 CAR-T 的结构基础和发展历程、CAR-T细胞治疗实体瘤常用靶点、影响CAR-T细胞治疗效果的因素以及CAR-T细胞治疗的优化等方面的最新研究进展，以期为后续CAR-T细胞治疗实体瘤提供思路。

2 CAR-T 的结构功能与发展历程

在CAR-T细胞中，研究人员利用基因编辑和基因转导技术对T细胞进行修饰，使其表面表达嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR），CAR能够结合肿瘤细胞表面的特定抗原，进而激活CAR-T细胞攻击和杀死肿瘤细胞［6］。典型的CAR结构包括三个主要部分：细胞外抗原识别区、跨膜区和细胞内信号转导区［7］。细胞外抗原识别区通常是由重链变异区和轻链变异区连接而成的单链可变区片段抗体（single-chain variable fragment，ScFv），主要负责识别并结合可识别肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA）或肿瘤特异抗原（tumor-specific antigen，TSA）。跨膜区是CAR-T细胞内域和外域之间的部分，该区域包括了膜外和膜内的氨基酸残基，负责将外域与内域连接在一起，并传递所识别的癌细胞抗原的信号，引导T细胞对癌细胞进行杀伤。细胞内信号转导区则负责提供T细胞活化所需的信号。

早在1989年CAR技术便已经被报道，直至1993年，Eshhar等人率先研制出第一代CAR-T细胞，历经30多年持续不断的改进和发展，CAR-T细胞已实现5代技术更迭［8］。最初的CAR细胞内信号转导区只有CD3-ζ链，在特异性识别肿瘤抗原和改善T细胞抗肿瘤活性方面是有效的。然而，由于缺乏胞内共刺激信号，并不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的抗肿瘤效应，临床疗效有限［9-10］。在第二代CAR中，共刺激信号（如CD28、4-1BB与CD3-ζ分子整合，CAR-T细胞增殖和细胞毒性反应显著改善。在第二代的基础上，第三代CAR结合了两个不同的共刺激结构域（如CD28-41BB- CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ），以期达到更好的信号传导的效果和肿瘤杀伤作用。但也有研究发现，与第二代相比，第三代CAR-T细胞杀伤活性并没有获得明显的提升［11-12］，因此，需要进一步的研究来探索这些治疗的安全性和有效性。第四代CAR是在第二代结构基础上引入了一个细胞内结构域，可共表达一些小分子物质（如促炎症细胞因子IL-12），以促进肿瘤微环境中CAR-T细胞的进一步活化，被称为 T 细胞重定向通用细胞因子介导的杀伤（T cells redirected for antigen-unrestricted cytokine-initiated killing，TRUCKs）。TRUCKs可增强 T 细胞活化，激活并吸引先天性免疫细胞，以消除靶向病变中的抗原阴性癌细胞［13］。第五代 CAR 基于第二代CAR 结构，在CD28和CD3ζ之间添加了激活其它细胞因子信号转导的共刺激结构域，如胞内IL-2受体β链（IL-2 receptor β-chain，IL-2Rβ）结构域和STAT3/5 的结构域，提供抗原依赖的细胞因子信号，并提高了CAR-T细胞增殖、存活和抗肿瘤活性［14-15］。

3 CAR-T 细胞治疗恶性实体瘤的常用靶点

3.1 表皮生长因子受体和表皮生长因子受体变体III

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和EGFR变体III（EGFRvIII）在多种癌症类型中的高表达。EGFRvIII约在30%的GBM患者中扩增，并且已经在临床试验中作为GBM肿瘤治疗的靶标进行研究［16］，此次试验中没有观察到最严重和最常见的毒性反应：细胞因子释放综合征和神经系统毒性；但同时，也没有观察到任何患者的MRI肿瘤明显消退。同样，在对晚期复发/难治性EGFR阳性非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者进行EGFR-CAR T细胞治疗的I期临床试验中，1例患者显示部分缓解，持续13个月以上，6例患者病情稳定，2例患者出现病情进展［17］。复发/转移性胆道癌EGFR阳性患者接受了1～3个周期的EGFR-CART细胞输注，1 例患者达到完全缓解，10例患者达到疾病稳定；但有3例患者出现≥3级急性发热/寒战；有患者出现与预处理治疗相关的1/2级靶介导毒性，包括黏膜/皮肤毒性和急性肺水肿以及≥3级淋巴细胞减少和血小板减少［18］。可见，靶向EGFRvIII和EGFR的CAR-T细胞对实体瘤的安全性和治疗效果仍有待进一步确定。

3.2 白介素13α2受体

白介素13α2受体（interleukin-13α2 receptor，IL-13Rα2）在超过50%的胶质母细胞瘤中过度表达，其表达随着恶性肿瘤分级的增加而增加，并与长期生存率降低有关［19］。E.Brown等人对3名肿瘤切除后复发性高级别胶质瘤（WHO III级和IV级）患者颅内注射IL13Rα2-CAR T细胞以治疗肿瘤。接受治疗的三名患者在复发后的平均生存期为11个月，最佳生存期接近14个月，且未观察到严重治疗相关副作用［20］。该研究团队也开展了另一项靶向IL13Rα2的同种异体 CAR T 细胞用于治疗复发性 GBM，尽管颅内和脊柱抗肿瘤作用在临床和影像学检查结果中显著，但作用是暂时的，仅持续约 7.5 个月，肿瘤在新区域复发［21］。

3.3 间皮素

间皮素（mesothelin，MSLN）是一种通过糖磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）结构域锚定在质膜上的糖蛋白，其表达通常局限于人体腹膜和胸膜腔的间皮细胞以及心包，但在多种实体肿瘤中均可观察到高表达［22］。因此，间皮素已经成为癌症免疫治疗一个有吸引力的靶标。

Pang等人在间皮素高表达的晚期胰腺癌 、卵巢癌患者中开展了I期临床试验，结果显示，MSLN高表达的晚期胰腺癌患者在输注靶向MSLN-CAR T细胞5次后，第240天CT显示完全缓解［23］。在另一项针对六名晚期胰腺癌患者的试验中，静脉注射靶向MSLN-CAR T细胞后疾病稳定，两名患者的无进展生存期（progression free survival，PFS）分别为3.8个月和5.4个月，并且没有观察到与肿瘤外毒性相关的不良并发症［24］。2021年11月，S.Adusumilli等人公布的一项MSLN- CAR T 治疗恶性胸膜间皮瘤的临床疗效数据，结果显示，在治疗评估截止时间时，23例恶性胸膜间皮瘤患者接受靶向MSLN-CAR T细胞治疗后中位随访时间为3.19个月，输注CAR-T细胞后的中位生存期为17.7个月，未观察到2级以上的细胞因子释放综合征或免疫效应细胞相关神经毒性综合征，未出现“脱靶效应事件”［25］。

此外，以人类表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）、双唾液酸神经节苷脂（disialoganglioside 2，GD2）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、CD70和Claudin18.2等为靶点的CAR-T治疗实体瘤的临床试验也正有序进行中，见表1。

表1 目前正在进行的CAR-T治疗实体瘤临床试验项目

4 影响恶性实体瘤中CAR-T 细胞疗效的因素

导致CAR-T细胞治疗实体瘤疗效不佳的因素有很多，如患者疾病进展、T细胞收获不足、CAR细胞制造延迟、CAR细胞产量低、内在T细胞缺陷等，但最主要的还是以下三种原因：缺乏肿瘤特异性抗原、CAR-T细胞运输和浸润肿瘤效率低下、肿瘤免疫微环境的抑制作用。

4.1 缺乏肿瘤特异性抗原

肿瘤抗原是细胞恶性转化过程中新出现和高表达的蛋白和多肽分子的总称。按肿瘤抗原和肿瘤的关系，肿瘤抗原主要分为两种：TSA和TAA。TAA是指并非肿瘤细胞所特有，正常组织细胞上也有低表达的抗原［26］。TSA又称新抗原，是指在肿瘤细胞中发生非同义点突变、密码子插入/缺失、移码突变、剪接突变和基因融合，导致蛋白质序列的发生改变后仅在肿瘤细胞上表达的抗原，相对于TAA更具特异性［27］。理想的CAR靶标应在整个肿瘤中、在多个患者中高度均匀地表达，并且在重要的正常组织中表达最少或没有表达。但遗憾的是，实体瘤的异质性高，很难获得用于CAR-T细胞治疗的理想TSA。

另一方面，低水平的CAR-T靶抗原表达也是实体瘤CAR-T治疗无效和疾病复发发生的重要因素［28-29］。Anurathapan等人在他们的研究中发现CAR-T细胞介导的肿瘤细胞杀伤程度与表达靶抗原的肿瘤细胞数量成正比；CAR-T杀伤能力与抗原表达强度相关，以及“低”抗原表达的肿瘤细胞能够逃避CAR介导的杀伤，最终导致肿瘤复发［30］。此外，在实体瘤中，输注特定靶向的CAR-T细胞进行治疗后，可能导致靶抗原表达下调，使CAR-T细胞无法识别肿瘤细胞，进而导致治疗失败。Fry等人的研究结果提示，B-ALL患者输注靶向CD22的CAR-T细胞治疗后中位缓解持续时间为6个月，复发与CD22位点密度降低有关［31］。

总体而言，不论是肿瘤特异性抗体的设计还是肿瘤细胞抗原表达的密度，都可以影响CAR-T细胞的抗肿瘤反应，严重限制了CAR-T在实体瘤中的应用。

4.2 CAR-T细胞运输和肿瘤浸润效率低下

CAR-T细胞治疗恶性实体瘤的基本前提是需要从血液中转运到肿瘤存在部位，从而与肿瘤细胞表面的抗原结合。具体而言，脉管系统中的CAR-T细胞迁移至肿瘤组织中，需要经历以下几个过程：（1）选择素-配体相互作用介导CAR-T细胞边集和附壁；（2）靶组织中的趋化因子激活CAR-T细胞上的趋化因子受体，活化的CAR-T细胞表达整合素使细胞紧密粘附于血管内皮细胞；（3）细胞间细胞黏附分子（intercellular cell adhesion molecules，ICAMs）、血管细胞黏附分子（vascular cell adhesion molecules，VCAMs）和趋化因子协同作用，使CAR-T细胞进行跨内皮迁移，破坏基底膜并最终离开血管渗入组织［32-35］。

事实上，在实体瘤中，任何旨在迁移、运输、浸润到肿瘤部位的CAR-T细胞都需要克服以上所有的物理障碍才能找到癌细胞进行接触，由此可见其运输过程之艰辛［36］。同时，肿瘤细胞也会做出相应的抵抗以抑制CAR-T细胞的渗出、迁移和浸润。黏附分子异常表达的异常脉管系统可减少CAR-T细胞附着和迁移［37-39］；CAR-T迁移、渗透和运输到肿瘤组织中所依赖的各种类型的趋化因子（如CCL5、CXCL9和CXCL10）表达下调或不表达；致密的肿瘤细胞外基质为CAR-T细胞进入肿瘤部位创造了物理屏障［40-41］；肿瘤细胞表达抑制性免疫检查点的配体，如程序性死亡-1配体（programmed death-1 ligand，PD-L1/L2）直接抑制T细胞功能［42］。因此，除了缺乏肿瘤特异性抗原外，CAR-T细胞如何尽可能多的运输至肿瘤组织也是一个令人棘手的问题。

4.3 肿瘤免疫微环境的抑制作用

为了识别和解决肿瘤细胞，浸润的CAR-T细胞必须停留在肿瘤组织中，并特异性结合肿瘤细胞表面抗原，进而激活一系列杀伤效应。但令人遗憾的是，众多研究人员已经证实T细胞代谢在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中可能受到强烈抑制［43-45］。

肿瘤细胞通过糖酵解代谢创造了一个以缺氧、高乳酸和高水平免疫抑制代谢物为特征的微环境，显著抑制抗肿瘤免疫细胞活性和功能。同时，肿瘤微环境中还存在不少癌症相关基质细胞，如癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）和抑制性免疫细胞，包括髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）、肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils，TANs）和调节性T细胞（regulatory cells，Treg），这些细胞和肿瘤细胞通过多种机制促进肿瘤发展，包括分泌生长因子、细胞因子和促进肿瘤生长、转移和血管生成的趋化因子［46-48］。CAFs是肿瘤相关基质的主要成分，可分泌细胞外基质蛋白、诱导炎症和新生血管形成、建立免疫抑制TME、重塑细胞外基质、抑制免疫细胞功能等方式促进肿瘤进展［49］。Treg细胞是一种调节多种免疫细胞功能的T细胞亚群，它们在抑制抗肿瘤免疫反应中起着关键作用［50］。一般认为，肿瘤微环境中的TAMs主要是M2型，通过分泌TNF-α和IL-10以促进PD-L1的表达，从而抑制抗肿瘤T细胞的功能，介导免疫逃逸［51］。TANs根据其活化、细胞因子状态和对肿瘤细胞生长的影响分为N1型（抗肿瘤）或N2型（促肿瘤）。TGF-β可诱导TANs分化成N2-TAN，后者又通过分泌CCL17招募Treg细胞［52］。另一方面，VEGF、IL-1、IFN-γ以及趋化因子CCL2，CCL4，CXCL1、CXCL12可刺激MDSCs的扩增，通过PEG-2募集到肿瘤部位，进而产生iNOS、精氨酸酶、IL-10和TGF-β，抑制淋巴细胞活性、募集Tregs和增加免疫抑制检查点分子的表达促使NK细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞失活。

5 克服实体瘤CAR-T 疗法障碍的策略

5.1 设计多靶标CAR-T细胞

由于肿瘤存在异质性和抗原逃逸，CAR-T细胞疗法的下一步发展可以从靶向一种以上的抗原入手，通过靶向肿瘤微环境中或多个TAA或其他因子来增加同时消除多个亚克隆群体的机会。已有不少临床前研究向我们展示了多靶标CAR-T细胞强大的抗肿瘤作用、减少免疫逃逸能力和提高T细胞活力作用［53-56］。具体而言，Hegde等人在胶质母细胞瘤中同时使用靶向HER2和IL-13Rα2特异性CAR-T细胞，在小鼠模型中显示出更强的肿瘤杀伤作用，且抗原逃逸更少［57］。Kakarla等人在已建立的A549小鼠肺癌模型中同时使用靶向EphA2和FAP的CAR-T细胞进行治疗，靶向FAP的CAR-T细胞的浸润显著减少了FAP阳性基质细胞，同时肿瘤生长减少。与单独使用任何一种相比，双靶标CAR-T细胞治疗显著增强了抗肿瘤活性并延长了小鼠生存时间［58］。

5.2 提高CAR-T迁移和浸润的策略

CAR-T细胞运输需要在效应T细胞和肿瘤细胞分泌的趋化因子和趋化因子受体之间建立趋化性迁移。例如将趋化因子受体整合到CAR设计中来刺激CAR-T细胞募集，增加CAR-T的抗肿瘤作用，如CCR2、CCR2b、CCR4、CCR7、CCR8、CXCR4和CXCR6。已有研究证实，IL-8受体CXCR1或CXCR2修饰的CAR显著增强了肿瘤组织中T细胞的迁移和抗肿瘤活性，从而在侵袭性肿瘤（如胶质母细胞瘤，卵巢癌和胰腺癌）的临床前模型中诱导肿瘤完全消退和持久的免疫记忆［59］。

通过腹膜内和肿瘤内注射区域直接注入也是增加CAR-T细胞浸润的直接途径。在I期临床试验研究中，研究人员通过肿瘤内注射将靶向ErbB的CAR-T细胞递送给头颈部鳞状细胞癌患者，不仅降低了细胞因子释放综合征发生概率，还最大程度减少CAR-T细胞消耗［60-61］。这种方法也适用于其他癌症，卵巢癌和恶性胸膜间皮瘤可以通过腹膜和胸膜腔将CAR-T细胞局部递送至肿瘤组织［62］。

肿瘤细胞的细胞外基质主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPG）［63］。HSPG的降解是T细胞通过富含基质的实体瘤的第一步。乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）是一种降解HSPG的酶。在体外扩增的CAR-T细胞中发现HPSE mRNA表达减少，由此限制了它们在实体瘤中的抗肿瘤功能。Caruanu等人设计了表达HPSE的CAR-T细胞，使其降解HSPG的能力提高，从而促进T细胞在实体瘤中的浸润［64］。

5.3 克服免疫抑制性TME

鉴于肿瘤免疫微环境的免疫抑制特性，研究人员正在研究改善肿瘤微环境的策略，以提高CAR-T细胞对实体瘤的存活率和疗效。

CAR-T细胞疗法与阻断抑制性免疫检查点（如PD-1/PD-L1、CTLA-4）的组合，可以显著增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性，而不会产生明显的毒性，已被应用于临床前模型和临床试验中提高治疗效果［65-67］。在临床前和临床研究中也已经应用了几种方法来靶向免疫抑制细胞和细胞因子。全反式维甲酸（tretinoin，ATRA）通过诱导未成熟的髓系细胞分化为成熟的树突状细胞，刺激T细胞，减少肿瘤微环境中的MDSC，与CAR-T细胞共同给药可增强抗肿瘤活性［68-69］。Tregs的消耗是另一种增强抗肿瘤免疫的有效方法，Agliardi G等人的研究表明，局部递送IL-12不仅减少Treg数量，增强CAR-T细胞的细胞毒性，而且还重塑TME，推动促炎CD4 + T细胞浸润［70］。靶向免疫抑制细胞因子来修饰CAR-T细胞，通过限制细胞因子诱导的抑制信号或将抑制信号转换为激活信号也被证实可进一步提高CAR-T细胞的功效。Tang等人用CRISPR/Cas2技术敲除CAR-T细胞中的内源性TGF-β受体II（TGFBR2），减少诱导的Treg转化并防止CAR-T 细胞的衰竭，在异种移植实体瘤模型中都显示了更好的体内肿瘤消除效果［71］。Stuber及其同事也发现在三阴性乳腺癌中，阻断TGF-β受体信号传导后可使靶向ROR1-CAR T细胞免受TGF-β的抑制作用，在体外和3D肿瘤模型中维持其抗肿瘤功能［72］。

简而言之，在肿瘤微环境中富集的抑制性免疫细胞或细胞因子可以作为提高CAR-T细胞功效的额外和有希望的靶标。为了克服肿瘤微环境中的各种障碍，与其他策略相结合将产生优异的肿瘤杀伤效果。

6 总结与展望

因此，CAR-T细胞疗法在肿瘤的临床应用中既是一个机会，也是一个挑战。伴随着患者需求的不断增加，不仅要借鉴CAR-T细胞治疗在血液肿瘤方面的成功经验，还要立足于实体肿瘤治疗所面临的特有问题深度思考，突破实体瘤应用的限制，推进临床研究的发展。同时，CAR-T与其它治疗手段联合应用于实体瘤方面的研究，将是未来癌症临床治疗领域一项重要发展方向，CAR-T细胞治疗有望更好、更安全地服务于更多患者。