猪流行性腹泻病毒逃逸宿主天然免疫研究进展

尹宝英,朱小甫,郑红青,邱存义

(1.咸阳职业技术学院 咸阳市动物疫病分子生物学诊断技术研究重点实验室,陕西咸阳 712000;2.西北农林科技大学,陕西杨凌 712100)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的一种急性、高度传染性肠道疾病,其特征是可以引起各日龄的猪出现呕吐、腹泻、脱水和厌食等症状,其中由于腹泻造成的电解质大量丢失和酸碱平衡失调可造成7日龄内的哺乳仔猪死亡率高达80%～100%。自2010年底国内PEDV变异毒株不断被发现,PEDV在长期的变异中已经进化出不同的策略来逃逸和破坏宿主的天然免疫系统以促进病毒的复制[1]。PEDV编码的多种结构蛋白和非结构蛋白,在病毒复制和包装中具有不同的功能作用,通过影响宿主细胞的凋亡、自噬、内质网应激等多项生命活动过程进而抑制宿主对病毒的免疫应答反应。以经典毒株为免疫原的PEDV商品苗已无法对流行变异PEDV毒株的感染提供有效保护[ 2 ]。

天然免疫是抵抗病原微生物入侵的一道重要防线,与获得性免疫相比,天然免疫具有应答迅速和特异性低等特点。模式识别受体(PRR)是宿主抵抗病原微生物的感应器,可识别具有病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs)或损伤相关分子模式(damage associated molecular pattern,DAMPs),从而引发先天性免疫反应。研究发现TRIM56(tripartite motif-containing protein 56)可以通过上调TLR3(Toll-like receptor 3)和TRAF3(TNF receptor associated factors 3 )通路介导的IFN-β(interferon β)的表达,而限制PEDV在猴胚胎肾上皮细胞(Marc145)中的复制;而FUBP3(far upstream element-binding protein 3 )则可通过上调TRAF3的表达来激活IFN-Ⅰ(interferon Ⅰ)信号通路,此外某些抗病毒蛋白在限制PEDV的感染过程中也发挥了重要的作用,例如PTPN14(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 14)在PEDV感染的Vero细胞中出现明显上调,PTPN14通过抑制 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)的磷酸化激活过程发挥作用,STAT3作为多种细胞因子和生长因子的下游效应分子,抑制IFN-Ⅰ的抗病毒活性[3-4]。

阐明病毒的抗免疫逃逸机制对了解宿主范围、嗜性、发病机制以及开发有效的疫苗和抗病毒药物以遏制PEDV在猪群中的传播至关重要。为了更好地了解PEDV与宿主之间的相互作用,进一步揭示PEDV逃逸宿主天然免疫的应答机制,本文就PEDV如何逃逸宿主天然免疫应答进行综述,以期为PED的防控和疫苗的研发提供新思路。

1 PEDV蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用

1.1 PEDV结构蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用

1.1.1 PEDV S蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 PEDV S蛋白是一种位于病毒囊膜上的Ⅰ型膜糖蛋白。根据功能和结构的不同,S蛋白的胞外结构域分为S1和S2两个区域,N端S1区域主要负责受体的结合,C端膜锚定的S2区域主要参与病毒包膜与宿主细胞膜的融合。当S1区域与受体结合时,S蛋白的构象发生变化,暴露蛋白酶裂解位点,随后被蛋白酶裂解为S1亚基和S2亚基,这有利于S2亚基中的融合肽插入宿主细胞膜并启动膜融合过程[5]。而PEDV可以利用宿主的 TMPRSS2(recombinant transmembrane protease serine 2)和MSPL(mosaic seine protease large-form)对S蛋白进行切割,从而促进病毒与宿主细胞的膜融合过程,提高病毒复制水平[6]。PEDV S蛋白还与 EGFRs(epithelial growth factor receptors)相互作用,通过JAK2/STAT3((Janus kinase 2/signal transducer and activator of tranion 3)信号通路下调 IFN-Ⅰ的表达,从而促进PEDV复制[7]。研究表明PEDV感染时通过激活线粒体细胞凋亡诱导因子诱导半胱天冬酶非依赖性凋亡,从而促进病毒复制,而PEDV S1蛋白是促进细胞凋亡的关键诱导剂[8]。因此,PEDV可能通过S蛋白诱导细胞凋亡来逃避宿主免疫反应,但是确切机制尚待进一步证实。

1.1.2 PEDV N蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 PEDV N蛋白是一种与基因组RNA结合的磷酸化核衣壳蛋白,在病毒复制、转录和组装过程中发挥重要作用。由于PEDV N蛋白在感染早期能产生高水平的表达,因此可以作为PEDV感染初期诊断的靶标。研究表明PEDV N蛋白可以通过猪肠上皮细胞中的Toll样受体TLR2、TLR3和TLR9途径活化NF-κB(nuclear transcription factor-κB ),也可以通过阻断NF-κB核易位来拮抗INF-λ的产生[9]。此外,PEDV N蛋白还可直接与 TBK1(TANK binding kinase 1)相互作用从而抑制IRF3(interferon regulatory factor 3)的活化和IFN-Ⅰ的产生[10],但TARDBP(TAR DNA binding protein)可以通过蛋白酶体和自噬降解途径降解N蛋白,上调Toll样受体信号通路中的一个关键接头分子MyD88(myeloid differentiation factor 88)的表达,激活IFN-Ⅰ信号传导,从而有效抑制PEDV复制[11]。

1.1.3 PEDV M蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 PEDV M蛋白是病毒颗粒外包膜的一种组分,属于Ⅲ型糖蛋白,由短氨基末端结构域和3个连续的跨膜结构域以及长羧基末端结构域组成。M蛋白通过细胞周期蛋白cyclin A途径诱导S期细胞周期停滞,下调eIF3L(eukaryotic initiation factor 3)的表达,促进病毒复制。Li S等[12]研究表明,PEDV M蛋白与IRF7的抑制结构域相互作用,显著抑制TBK1/IKKε(TANK-binding kinase-1/IκB kinase-ε)诱导的干扰素调节因子IRF7的磷酸化和二聚化,导致IFN-I表达降低,但该过程不影响TBK1/IKKε与IRF7之间的相互作用。此外,PEDV M蛋白可以与 HSP70(heat shock protein 70)形成复合物从而影响宿主的天然免疫反应和病毒复制[13]。

1.1.4 PEDV E蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 E蛋白是PEDV中最小的结构蛋白,参与PEDV病毒粒子组装和出芽等过程。E蛋白主要定位于内质网中,引起内质网应激并激活NF-κB通路,该通路负责上调IL-8(interleukin-8)和抗凋亡蛋白Bcl-2(B-cell CLL/lymphoma 2)的表达。关于PEDV E蛋白的研究较少,Zheng L等人[14]发现过表达PEDV E蛋白,可以显著下调了IFN-β和 ISG(interferon-stimulated genes)的表达,还可直接作用于IRF3,干扰了其核转位。

1.1.5 ORF3蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 ORF3蛋白是PEDV基因组编码的唯一辅助蛋白,与PEDV毒力有关。ORF3通过凋亡和自噬途径影响病毒的复制,即一面通过直接抑制感染细胞的凋亡来增强病毒增殖,另一方面通过促进自噬标记物胞浆型向自噬体膜型的转化来诱导自噬发生。ORF3蛋白可聚集在内质网中,通过上调GRP78(glucose regulated protein)表达和激活PERK-eIF2a(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase-eukaryotic translation initator factor 2)信号通路来触发内质网应激反应,从而激活旨在恢复蛋白质稳态的未折叠蛋白反应,触发细胞死亡和自噬[15]。Wu Z等[16]发现PEDV ORF3可通过下调NF-κB p65蛋白的表达和磷酸化水平来阻碍其活化和核转位。另外,ORF3蛋白可通过与S蛋白互作,促进病毒的复制,但是其发挥调节作用的具体机制,有待进一步研究。

1.2 PEDV非结构蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用

1.2.1 nsp1蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 nsp1蛋白通过打断IRF3和CREB (cAMP response element B )之间的连接结构从而抑制IFN-I表达的,并不干扰IRF3磷酸化和核易位。线粒体MAVS(mitochondrial antiviral signaling)蛋白主要诱导IFN-I的产生,过氧化物酶体MAVS则主要诱导IFN-λ的产生,而IRF1对于IFN-λ的过氧化物酶体MAVS依赖性激活途径具有重要的调控作用。nsp1可阻断IRF1的核易位和减少过氧化物酶体的数量,从而抑制IRF1诱导的Ⅲ型IFN的表达[17]。Shen Z等[18]研究表明包括PEDV和TGEV在内的七种具有代表性的α-冠状病毒的 nsp1s可以显着抑制STAT1向S727的磷酸化并干扰IFN-Ⅰ的产生。

1.2.2 nsp2蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 nsp2是PEDV高变区, 研究发现其可通过作用于泛素连接酶FBXW7,增强RIG-I和TBK1表达和诱导ISGs的表达促进宿主细胞的抗病毒天然免疫,还可促进FBXW7通过K48连接的泛素-蛋白酶体途径降解,从而下调宿主的抗病毒水平[19]。

1.2.3 nsp3蛋白和nsp5蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 PEDV nsp3编码具有去泛素化酶活性的PLP2(papain-like protease 2),通过去泛素酶活性来拮抗RIG-I(retinoic acid-inducible gene 1)和STING(stimulator of interferon genes)介导的信号转导对IFN-β的表达进行负调控。同为冠状病毒的SARS-CoV2也具有去泛素酶活性。当机体感染后SARS-CoV2,SARS-CoV2-Plpro可以通过降解ISG15的靶蛋白IRF3,从而削弱INF-Ⅰ应答,同时SARS-CoV2-Plpro对于TBK1和IRF3磷酸化及IRF3的核易位也具有较强的抑制作用,通过去除TRAF3和TRAF6的Lys63连接的多聚泛素化,抑制 TLR7 信号通路[20]。nsp5编码的3C样蛋白酶特异性靶向NEMO谷氨酸231以切割NEMO残基,从而拮抗IFN-I的产生和下游RIG-I/MDA5信号通路的激活[21]。

1.2.4 nsp7蛋白在拮抗宿主抗病毒天然免疫中的作用 核转运受体蛋白KPNA1(karyopherin α1)作为核定位信号蛋白,参与STAT1和STAT2的核易位过程。而PEDV nsp7可与STAT1 / STAT2的DNA结合域相互作用,竞争性抑制KPNA1与STAT1的结合,但nsp7不影响JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2等蛋白的磷酸化水平及ISGF3(interferon-stimulated gene factor 3)复合物的形成[22]。

1.2.5 nsp15蛋白在拮抗宿主抗病毒天然免疫中的作用 2020年Wu 等[23]研究发现PEDV nsp15可直接依赖其内切核糖核酸酶活性降解TBK1和IRF3的mRNA水平以下调TBK1和IRF3的表达,从而抑制IFN的产生并限制ISGs的诱导,协助PEDV逃逸宿主的天然免疫。2021年Gao 等人[24]证明IBV nsp15通过减少dsRNA积累逃避蛋白激酶的识别从而抑制应激颗粒SGs(stress sranules)的形成,并且nsp15的EndoU活性是抑制 SGs 形成所必需的。而在过表达PEDV nsp15的猪肾细胞(LLC-PK1)中同样检测到eIF2α依赖性和非依赖性SGs的形成受到抑制。在多种过表达冠状病毒nsp15的细胞中发现了PKR-eIF2α-SGs信号传导阻滞的现象,这表明具有高度保守的催化核心结构域的nsp15可能在拮抗冠状病毒的整体反应中起重要作用。

1.2.6 PEDV其他非结构蛋白在拮抗宿主抗病毒天然免疫中的作用 PEDV nsp6可以诱导自噬,并通过PI3K/Akt/mTOR信号通路促进PEDV在猪小肠上皮细胞内进行复制[25]。PEDV nsp16下调RIG-I和MDA5(melanoma-diffentiation-associatedgene5)介导的IFN-β及ISGs的表达。此外,在过表达nsp16的细胞中IFIT(interferon induced proteins tetratricopeptiderepeats)家族成员IFIT1、IFIT2和IFIT3的mRNA水平受到抑制。另发现nsp10可增强了nsp16对IFN-β的抑制作用[26]。

2 其他因素对于PEDV拮抗天然免疫的影响

2.1 自噬对于PEDV感染的影响

病毒自噬一方面增强宿主的抗病毒天然免疫,另一方面促进病毒复制。病毒自噬对病毒复制的影响可能取决于病毒本身的特性。Guo X等人[27]运用自噬调节药物研究自噬对PEDV感染的具体影响,发现自噬抑制剂3-MA(3-methyladenine)在 PEDV感染早期阶段能够抑制病毒的复制,而CQ(chloroquine)则在PEDV感染后期阶段抑制病毒的复制。此外,雷帕霉素诱导的自噬提高了病毒滴度。为进一步评估自噬对PEDV复制的影响。通过沉默两种自噬必需的关键调节因子Beclin1和ATG5(autophagy 5)抑制了PEDV的复制。这些结果表明,自噬诱导可能有益于PEDV复制。但有研究表明雷帕霉素诱导的自噬抑制了IPEC-J2中的PEDV感染[28]。Kong N等人[29]发现BST2(bone marrow stromal cell antigen 2)通过募集泛素连接酶泛素化PEDV N蛋白,泛素化的N蛋白被CALCOCO2/NDP52( calcium-binding and coiled-coil domain 2/nuclear dot protein 52)识别并转运至自噬小体,通过自噬-溶酶体途径降解,从而抑制PEDV的复制。因此,自噬对于PEDV复制的影响仍需进一步探索。

图1 PEDV蛋白与部分PRR信号通路互作网络示意图Fig.1 Diagram of interaction network between PEDV protein and partial PRR signaling pathway

2.2 PEDV通过隐藏PAMPs逃避宿主天然免疫

病毒某些结构的内切核糖核酸酶活性及5' Cap结构有助于病毒避免自身的 RNA 被识别和降解。PEDV nsp15具有内切核糖核酸酶活性,可以通过减少dsRNA的积累,逃避MDA5、PKR(protein kinase R )等PRRs的识别。PEDV nsp16是一种甲基转移酶,参与病毒RNA的加帽。这种修饰使病毒RNA与宿主细胞mRNA无法被区分,从而避免被MDA5识别。RNA病毒在复制过程中产生的dsRNA和 5'-三磷酸RNA可以被PRRs识别。但是如SARS-CoV-2等冠状病毒可以将内质网转化为双膜囊泡,为病毒RNA的复制提供一个安全的场所,从而逃避宿主模式识别受体的识别。而双膜囊泡是否在PEDV的感染过程中对其提供同样的保护,仍有待进一步证实。

2.3 其他途径介导PEDV逃避宿主天然免疫

Guo等人[30]发现PEDV通过泛素-蛋白酶体途径介导p-STAT1的降解,抑制干扰素信号传导。PEDV的感染诱导半胱天冬酶-8介导的Ras-GTPase激活蛋白结合蛋白1裂解并破坏应激颗粒的形成以促进病毒复制[31]。PARD3(partitioning defective 3),一种结构域蛋白家族成员,作用是建立和维持上皮细胞间的紧密连接,PEDV可通过蛋白酶体依赖途径降解PARD3,从而促进完成自身增殖[32]。

3 展望

PEDV在长期演变中已经进化出多种拮抗宿主天然免疫反应的策略,如抑制IFN的产生,包括阻碍RIG-I/TLR信号传导、抑制dsRNA与RIG-I/MDA5结合或直接下调IFN启动子活性。PEDV的E蛋白、N蛋白和ORF3蛋白都可以通过PERK和IRE1(inositol-requiring enzyme 1)信号传导诱导ER 应激,上调炎症因子的表达。此外,PEDV还通过靶向NF-κB信号通路来减弱炎症反应。除上述途径外,宿主细胞的生理过程如自噬、内质网应激和凋亡可能也参与了PEDV逃避天然免疫反应的过程,如PEDV nsp6 通过PI3K/Akt/mTOR途径诱导自噬,以促进病毒的复制[25]。但自噬、内质网应激和凋亡等生理过程对于PEDV感染的确切影响及具体机制仍有待进一步研究。