儿茶素对金黄色葡萄球菌脂磷壁酸诱导的小鼠乳腺炎的影响

于井成,付志新,沈菩秀,黄先凯,龙小川,王新庄*

(1.河南农业大学动物医学院,河南郑州 450046;2.河南省科学技术情报中心,河南郑州 450003;3.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025)

奶牛乳腺炎是奶牛生产中的常见病,可造成牧场及企业的巨大经济损失,严重制约奶牛产业的发展,奶牛乳腺炎导致奶牛产奶量减少,产奶品质下降,生长发育缓慢,繁殖力降低,产奶年限缩短和死亡淘汰率上升,同时还因为治疗以及预防不当造成乳中兽药和抗生素的残留,危机人类的身体健康以及污染环境,导致环境安全问题日益突出[1]。乳腺炎是由微生物感染和理化刺激引起的奶牛乳腺炎症,其特点是乳中体细胞尤其是白细胞增多,以及乳腺组织发生病理变化[2]。奶牛乳腺炎的主要的致病原因其一是由于病原微生物的感染,分为接触传染性病原菌和环境性病原菌,前者主要有无乳链球菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌等,后者主要是革兰氏阴性菌,如大肠埃希氏菌、克雷伯氏菌和沙雷氏菌等[3-4]。引发奶牛乳房炎的主要病原微生物之一是金黄色葡萄球菌,而LTA(lipoteichoic acid)是金黄色葡萄球菌细胞壁的主要组成成分之一,可导致宿主产生不同的免疫应答。LTA能激活炎症细胞从而引起炎症反应,是引起炎症的关键细胞毒性因子[5]。

儿茶素类化合物广泛分布于绿茶等多种食物和药用植物中,普遍具有生物活性,其活性成分为儿茶素和表儿茶素等。现有文献表明,绿茶中所含儿茶素的抗氧化活性及其对预防疾病的能力很大程度上取决于分子中的结构基团以及羟基的数量,可保护心脑血管,降低炎症反应(如降低佐剂性关节炎大鼠的继发性炎症),降低纤维化,减少中性粒细胞和肥大细胞浸润等[6];也有研究表明摄入的儿茶素可以通过抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的分泌和NF-κB通路的磷酸化水平来改善PM2.5诱导的小鼠全身炎症[7];还有研究发现儿茶素的抗炎潜能是通过抑制LPS(lipopolysaccharide)刺激细胞中COX2、iNOS、NO和TNF-α等的产生而发挥作用的,而对这些不同炎症介质产生的抑制作用似乎是通过抑制NF-κB和MAP激酶激活来介导的[8]。这些表明儿茶素有潜力被开发成一种治疗多种炎症的抗炎治疗药物,也可以建议在营养制剂中使用儿茶素作为抗炎成分。本试验通过测量低、中、高浓度的儿茶素的作用效果,探讨儿茶素对于小鼠乳腺炎模型的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 7周龄左右、健康的雌性昆明小鼠购自河南春盈生物公司,室温下培养,自由进食进水。将分娩后5～10 d健康昆明雌鼠分为6组,即对照组(CG)、LTA致炎组(LTA)、LTA+10 mg/kg儿茶素组(D1)、LTA+20 mg/kg儿茶素组(D2)、LTA+30 mg/kg儿茶素组(D3)、LTA+5 mg/kg地塞米松组(DEX),每组3只重复。

1.1.2 动物伦理 动物实验开展经河南农业大学实验动物使用委员会批准。批准文号:2005-0026。

1.1.3 主要试剂 LTA(L2515-5MG,5 mg/mL),西格玛奥德里奇上海贸易有限公司产品;儿茶素(154-23-4,HPLC≥98%),四川维克奇生物科技有限公司产品;超敏ECL化学发光试剂盒(G2020-25ML)、4%多聚甲醛固定液(G1101),武汉赛维尔生物科技有限公司产品;BCA蛋白定量试剂盒(E211-02555)和反转录试剂盒(R223-01),南京诺维赞生物科技有限公司产品;RIPA裂解液(M,C05-01001)、蛋白酶抑制剂混合物(哺乳动物,100X,PIC008)、β-actin一抗(bsm-33036M)、β-actin二抗(bs-40296G-HRP)和IκBα(bs-287R),北京博奥森生物技术有限公司产品;荧光染料Mix(TSE201)和Trizol试剂,北京擎科生物科技有限公司产品;地塞米松(S17003-5g),源叶生物科技有限公司产品;NF-κB p65一抗(WL01273b)、p-NF-κB p65(WL02169)、p-IκBα(WL02495),万类生物科技有限公司产品;HRP标记的二抗(Proteintech,SA-00001-2),河南天驰生物技术有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 酶标仪(Spark),上海帝肯贸易有限公司产品;化学发光式分析仪(Tanon-5200),上海天能科技有限公司产品;基因扩增热循环仪(Genesy 96T),西安天隆科技有限公司产品;实时荧光定量PCR仪(qTOWER3/G),德国耶拿公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 分娩后5～7 d正常泌乳的雌性小鼠,造模前与仔鼠隔离后按照随机分配原则随机分为6组,每组3只,称重记录数据,注射质量浓度为1 mg/kg的LTA溶液诱导24 h来建立小鼠乳腺炎试验模型[9],具体操作大体同文献记载[10]并稍作改动,乙醚吸入麻醉小鼠,充分暴露第4对乳腺及周围皮肤,暴露乳导管,用注射器从小鼠第4对乳腺的乳头口轻轻插入乳导管内,轻挑针尖至乳头正下方的乳池内注射LTA溶液。24 h后对药物处理组腹腔注射质量浓度为10 mg/kg、20 mg/kg和30 mg/kg的儿茶素[11]及5 mg/kg的地塞米松[12],药物处理24 h后,称量小鼠的体重并记录。眼球采血:左手保定小鼠,用手术剪剪除小鼠的胡须,将小鼠倒置,使小鼠的眼球充血并暴露,弯镊摘除眼球,收集血液于EDTA抗凝管内,送往武汉塞维尔生物科技有限公司进行血液细胞分析。采血完成后,采用颈椎脱臼法处死,手术剪剥开皮肤,暴露第3对乳腺,观察大小,颜色,是否出血肿胀和脓肿的情况,并拍照。一部分进行HE染色,在显微镜下观察组织切片,观察管泡状腺和小叶间导管的病变情况;另一部分放到无菌无酶EP管中于-80℃的冰箱冷冻保存,用于后续试验。

1.2.2 组织炎症因子检测 -80℃冰箱取出小鼠乳腺组织,加入到含有Trizol的无菌无酶EP管内,随后每个无菌无酶EP管内加入相同数目和大小的钢珠,在全自动样品快速研磨仪中进一步研磨组织。随后按照Trizol醇沉法来提取组织RNA。提取好的RNA根据反转录试剂盒说明书反转录成cDNA,之后进行RT-qPCR (real-time fluorescence quantitative PCR)反应。检测的促炎因子引物如表1所示。

表1 促炎因子引物序列Table 1 Pro-inflammatory factor primer sequences

1.2.3 组织蛋白检测 取小鼠乳腺组织,加入混合的蛋白裂解液,全自动组织研磨仪进行组织研磨,后置于冰上裂解10～20 min,12 000 r/min,4℃离心10 min,离心结束吸取上清于新的EP管备用。BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,根据提取到的蛋白浓度,确定各组需加入的蛋白含量。配备10% SDS-PAGE凝胶,完成电泳、转膜,室温下5%脱脂奶粉封闭1 h,封闭结束后加入稀释好的待测一抗β-actin、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα和IκBα,β-actin的稀释比例为1∶5 000,其余的皆为1∶1 000,4℃孵育过夜。TBST清洗3次,10 min/次。用HRP标记的二抗室温孵育1 h,TBST清洗3次,10 min/次。最后用超敏ECL化学发光液显影,Image J软件进行灰度分析。

2 结果

2.1 小鼠体重变化及分析

测量小鼠处理前的体重、给药后准备解剖时的体重。如表2所示,经过处理后小鼠的体重都有减少,对照组小鼠未经任何处理,体重变化量最少,LTA致炎组小鼠的体重变化最大,LTA+5 mg/kg地塞米松组的小鼠和LTA+20 mg/kg儿茶素组的小鼠体重变化较少。

表2 小鼠体重变化Table 2 Weight changes in mice

2.2 小鼠乳腺剖检观察

小鼠经眼球采血后处死,剖检观察乳腺的颜色、大小、是否充血肿胀等情况,如图1所示,A为空白对照组的小鼠,乳腺颜色正常呈乳白色且大小形状正常;B为LTA致炎组的小鼠,乳腺颜色明显发红、可见组织充血肿胀症状;C为LTA+5 mg/kg地塞米松组,与LTA组相比,红肿状况和血管充血状况有所缓解;D、E、F分别为LTA+10 mg/kg儿茶素组、LTA+20 mg/kg儿茶素组,LTA+30 mg/kg儿茶素组,3个组可观察到血管充血症状有明显的减轻且组织肿胀也有所缓解。从整体比较来看,浓度为20 mg/kg的儿茶素具有较好缓解效果。

A.对照组;B.LTA致炎组;C.LTA+5 mg/kg地塞米松组;D.LTA+10 mg/kg儿茶素组;E.LTA+20 mg/kg儿茶素组;F.LTA+30 mg/kg儿茶素组A.control group; B.LTA inflammatory group; C.LTA+ dexamethasone drug treatment group; D.LTA+ catechin (10 mg/kg) group; E.LTA+ catechin (20 mg/kg) group; F.LTA+ catechin (30 mg/kg) group图1 不同处理组小鼠乳腺组织解剖图Fig.1 Anatomy of mammary gland tissue in different treatment groups

2.3 小鼠血液分析

眼球采血并利用仪器进行血常规的检查,各个细胞数目的参考范围是根据检测仪器三分类血球仪所自带的结果。如表3所示,LTA刺激后白细胞、单核细胞等数目超过正常参考范围,引起了炎性细胞向病变组织聚集;中浓度剂量的儿茶素治疗后,白细胞数、淋巴细胞、单核细胞数、中性粒细胞数目等总体下降较为明显;地塞米松治疗后白细胞数、淋巴细胞、单核细胞数等处于参考范围之内,结果表明中浓度的儿茶素有一定的治疗效果。

表3 血液细胞学分析数据Table 3 Blood cytological analysis data

2.4 HE染色结果及病理分析

结果显示,每组小鼠组织腺泡都有密集增生,局部脂肪组织大小不均匀,有充血、出血、淤血、水肿、变性、增生等基本病理改变,对典型病变部位成像用箭头标注。如图2所示,对照组的腺泡显著密集增生,导管中偶见脱落的细胞,少量细胞破碎。5 mg/kg地塞米松治疗后可见腺泡中度增生,分布不均匀;多量腺泡及导管中充满嗜酸性分泌物,导管中偶见脱落的细胞。LTA致炎组病变最为严重,可见腺泡显著密集增生,分布均匀,较多腺泡及导管中可见嗜酸性分泌物,导管中偶见脱落的细胞,少量细胞坏死,胞核碎裂或溶解,伴有中性粒细胞点状浸润;局部可见较多钙化灶;局部脂肪细胞大小不均匀,少量细胞破碎。LTA+10 mg/kg儿茶素组较LTA致炎组变化略轻,乳腺可见腺泡轻度增生,分布不均匀;腺泡及导管中少见嗜酸性分泌物,导管中偶见脱落的细胞,伴有少量淋巴细胞浸润,少量细胞破碎。LTA+20 mg/kg儿茶素组可见腺泡中度增生,分布不均匀;多量腺泡及导管中充满嗜酸性分泌物,较多上皮变性,胞质疏松淡染,伴有少量淋巴细胞浸润,偶见钙化灶。LTA+30 mg/kg儿茶素组可见腺泡轻度增生,分布不均匀;腺泡及导管中少见嗜酸性分泌物,导管中偶见脱落的细胞,少量上皮变性,胞质疏松淡染,伴有中性粒细胞点状浸润。结果表明儿茶素具有一定的治疗效果,且低、中浓度的儿茶素具有较好的治疗效果。

A.对照组;B.LTA+5 mg/kg地塞米松组;C.LTA致炎组; D.LTA+10 mg/kg儿茶素组;E.LTA+20 mg/kg儿茶素组;F:LTA+30 mg/kg儿茶素组.腺泡及导管中充满嗜酸性分泌物,导管中脱落的细胞(黑色箭头);细胞破碎(棕色箭头);淋巴细胞浸润(红色箭头);钙化灶(黄色箭头);细胞坏死,胞核碎裂或溶解(绿色箭头);上皮变性,胞质疏松淡染(蓝色箭头)A.Control group; B.LTA+ dexamethasone drug treatment group; C.LTA group; D.LTA+ catechin (10 mg/kg) group; E.LTA+ catechin (20 mg/kg) group; F.LTA+ catechin (30 mg/kg) group.Acinar and catheter filled with eosinophilic secretions,shed cells in catheter (black arrow); Cell fragmentation (brown arrow); Lymphocyte infiltration (red arrow); Calcification foci (yellow arrow); Cell necrosis,nucleus disintegration or lysis (green arrow); Epithelial degeneration,loose cytoplasm light staining (blue arrow)图2 小鼠乳腺组织H&E染色结果(20×; 标尺规格为50 μm)Fig.2 Results of H&E staining of mouse mammary gland tissues (20×; Scale size is 50 μm)

2.5 促炎因子mRNA表达结果

利用RT-qPCR方法检测小鼠乳腺组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。结果表明,与对照组(CG)相比,LTA组小鼠乳腺组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达显著升高(P<0.05);不同质量浓度儿茶素及地塞米松处理后,乳腺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著低于LTA组(P<0.05)(图3)。

CG.对照组;LTA.LTA致炎组;D1.LTA+10 mg/kg儿茶素组;D2.LTA+20 mg/kg儿茶素组;D3.LTA+30 mg/kg儿茶素组;DEX.LTA+5 mg/kg地塞米松组CG.Control group; LTA.LTA inflammatory group; D1.LTA+ catechin (10 mg/kg) group; D2.LTA+ catechin (20 mg/kg) group; D3.LTA+ catechin (30 mg/kg) group;DEX.LTA+ dexamethasone drug treatment group图3 不同处理组IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达量Fig.3 mRNA expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in different treatment groups

2.6 NF-κB信号通路蛋白表达结果

蛋白免疫印迹法检测小鼠乳腺组织中NF-κB信号通路的表达,结果显示,与对照组相比而LTA致炎后表达均上升且高于其他组,LTA+5 mg/kg地塞米松组、LTA+10 mg/kg儿茶素、LTA+20 mg/kg儿茶素和LTA+30 mg/kg儿茶素p-NF-κB p65和p-IκBα的表达均有下降,其中LTA+20 mg/kg儿茶素p-NF-κB p65和p-IκBα的表达下降最明显(图4)。表明儿茶素对小鼠的的乳腺炎有治疗效果。

CG.对照组; LTA.LTA致炎组; D1.LTA+10 mg/kg儿茶素组;D2.LTA+20 mg/kg儿茶素组;D3.LTA+30 mg/kg儿茶素组;DEX.LTA+5 mg/kg地塞米松组CG.Control group; LTA.LTA inflammatory group; D1.LTA+ catechin (10 mg/kg) group; D2.LTA+ catechin (20 mg/kg) group; D3.LTA+ catechin (30 mg/kg) group; DEX.LTA+ dexamethasone drug treatment group图4 不同处理组NF-κB信号通路中p-p65和p-IκBα蛋白表达(A)、量化分析(B、C)Fig.4 Expressions of p-p65 and p-IκBα proteins in NF-κB signaling pathway in different treatment groups (A),quantitative analysis (B,C)

3 讨论

因奶牛的研究成本过大,本试验采用小鼠为试验动物来探究儿茶素对奶牛乳腺炎的治疗效果。本试验通过乳导管注射LTA构建小鼠乳腺炎模型并对其进行观察和研究,LTA能够引起宿主组织器官的炎性病理损伤,常被用作模拟金黄色葡萄球菌诱导体内和体外乳腺。细胞因子是炎症反应的指标,包括促炎症因子和抗炎症细胞因子[13]。IL-1β、IL-6和TNF-α是由单核细胞、内皮细胞成纤维细胞等炎症细胞在应答感染时产生的促炎因子。IL-1β可趋化并激活中性粒细胞,进一步促进炎症反应的进行。TNF-α在早期的炎症反应中发挥了重要作用,它可引起激发状态的免疫细胞产生更多的炎性介质,形成“瀑布式反应”,从而引起组织损伤。IL-6具有增强TNF-α损害的作用,诱导T细胞、B细胞淋巴细胞分化,放大炎症反应,从而导致组织细胞损伤[14]。NF-κB作为信号转导途径的枢纽,与免疫、细胞凋亡、炎症等生理过程有着密切联系,是一种重要的核转录因子[15]。Ryu Y H[16]等研究发现LTA可激活鼠巨噬细胞表面TLR2及转录因子NF-κB,引起TNF-α和NO的分泌并具有浓度及时间依赖性。推测LTA可通过TLR2信号转导途径将炎症信号转到细胞内,并引起转录因子NF-κB的激活,导致炎性因子的分泌和释放。本实验结果表明以LTA作为诱炎物质诱导小鼠乳腺组织,HE染色镜检观察小鼠组织腺泡密集增生,有充血、出血、水肿、变性、增生等病理改变;对于NF-κB信号通路来说LTA诱导后该通路被明显激活,IL-1β、IL-6、TNF-α促炎因子基因表达极显著升高(P<0.01)。

目前在临床上应用较为广泛的药物是抗生素类药物,容易导致耐药菌的产生、抗生素残留等问题。治疗奶牛乳腺炎的中药里比较常见的是蒲公英、金银花、黄芪、连翘和丹参等5味药,以苯甲醇为辅料制成的蒲公英注射液,还有以蒲公英、连翘、金银花、黄芪以及党参等按照科学的配比制成的乳炎灵注射液等[17]。地塞米松是已发现的具有治疗奶牛乳腺炎作用的药物之一,具有较强的抗炎、增强血管紧张度、减少血管充血及降低血管通透性的作用,在早期应用能抑制多种原因如免疫功能低下及病原生物等引起的炎症反应[18]。儿茶素属于茶多酚的一种,是茶多酚发挥作用的主要物质,在可可、葡萄、茶以及其他许多水果和蔬菜中含量丰富,具有抗菌、抗肿瘤、清除自由基、延缓衰老、抑制肥胖、抗病毒等作用,且有研究证实茶多酚可抑制或杀死金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、百日咳杆菌、痢疾杆菌和霍乱弧菌等[19]。表儿茶素(epicatechin,EC)与表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、表没食子儿茶素没食子酸(epigallocatechin gallate,EGCG)共同构成了儿茶素的主要成分[20]。周露露等证实儿茶素具有足够的潜力,通过细胞和体液机制调节免疫活性,增强机体的抵抗力[21],许君等发现绿茶儿茶素可调节肝富集转录因子的表达,起到抗乙型肝炎病毒的药理作用[22]Musial C发现羟基的数量和特征结构基团的存在对儿茶素的抗氧化活性存在巨大影响[23]。Bai L发现绿茶的儿茶素具有广泛的对革兰氏阴性菌和阳性菌的抗菌活性[24]。Ohishi T发现儿茶素中的EGCG可作为抗氧化剂清除活性氧,进而导致NF-κB信号通路受到抑制[25]。因此本实验通过建立小鼠乳腺炎模型并运用儿茶素进行治疗,同时使用已知具有一定治疗效果的地塞米松进行对比,探究儿茶素对LTA诱导的乳腺炎的影响,为之后儿茶素新药的研究开发奠定基础。本试验结果表明经不同质量浓度儿茶素处理后组织损伤有不同程度的缓解,NF-κB信号通路及促炎因子表达受到抑制,综合结果表明中浓度(20 mg/kg)的儿茶素对于LTA诱导的小鼠乳腺炎有较好的治疗作用,为治疗奶牛乳腺炎的治疗提供新的思路。