Bay 60-7550 对脊髓损伤大鼠机械痛阈及细胞极化的影响 *

杨文洁 孙 涛 韩 杰 杨 磊 王珺楠△

（1 山东第一医科大学附属省立医院疼痛科，济南 250021；2 山东大学威海市立医院疼痛科，威海 264200）

神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)后常见且难以控制的并发症之一[1]。据统计，全球SCI 发病率为30～40/（100万·年），我国各地综合发病率为23.7/（100 万·年），其中有53%～80%的人会出现NP[2]。其临床表现复杂多样，疼痛剧烈、迁延难愈，严重影响了病人的生活质量，导致抑郁甚至自杀[3]。目前脊髓损伤后神经病理性疼痛 (SCI-induced neuropathic pain, SCI-NP)的治疗主要有药物治疗和非药物治疗两种方案，其中药物治疗是SCI-NP 最基础及最常用的方法，包括一线的抗惊厥药、三环抗抑郁药，二、三线的曲马多、阿片类镇痛药、非甾体抗炎药等，但长期应用药物导致的耐受性、依赖性及药物滥用等不良反应仍是临床治疗的挑战[4]。同时，由于SCI-NP 具体机制复杂不明，不同病人间临床疗效个体差异较大，目前尚缺乏更有效的治疗方案。因此，积极探索SCI-NP 的发病机制，寻找有效的药物及手术治疗靶点，是当前亟待解决的问题。

SCI-NP 发病机制复杂，中枢敏化是NP 发展和维持的基础。研究证明，SCI 后持续增加的炎症反应通过形成中枢敏化介导NP，而损伤区小胶质细胞/巨噬细胞极化失衡在形成中枢敏化过程中发挥重要作用[5]。文献表明，小胶质细胞/巨噬细胞表型转换是一个动态重叠的过程[6]，改善抗炎微环境，逆转其极化失衡，可能是更具优势的SCI-NP 治疗策略。

环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和环磷酸鸟苷 (cyclic guanosine monophosphate, cGMP)是细胞内重要的第二信使，已被证明对细胞免疫反应具有负性调节作用[7]。磷酸二酯酶(phosphodiesterases, PDEs)是细胞内唯一可调节cAMP 和/或cGMP 水平的关键酶，包括11 种同工酶(PDE1-PDE11)[8]。其中，磷酸二酯酶-2A (phosphodiesterase-2A, PDE2A) 是一种被cGMP 刺激可同时降解cAMP 和cGMP 的双底物酶，其广泛分布于人体的大脑等多种组织中；近年来，PDE2A 在治疗心力衰竭、改善学习及认知功能、改善抑郁焦虑样行为等方面成为重要的研究靶点[9]。Beshay 等[10]通过小鼠体内及RAW-264.7 巨噬细胞系体外实验证明PDE抑制剂可抑制巨噬细胞活化和一氧化氮生成，因此也是多种免疫过程的有效调节剂。最近一项研究表明，PDE2 抑制剂Bay 60-7550 可缓解轻度睡眠不足模型小鼠的持续术后疼痛，但Bay 60-7550 镇痛的具体机制尚不清楚[11]。此外，PDE2A 在大鼠脊髓背角和背根神经节的神经元细胞中含量较丰富，并推测其在伤害性信息的处理中发挥重要作用[12]。然而，目前国内外尚无PDE2A-小胶质细胞/巨噬细胞极化在SCI-NP 模型中的研究。因此，本研究通过建立大鼠SCI-NP 模型，观察选择性PDE2A 抑制剂对SCI-NP的抗炎和镇痛效果，探究PDE2A-小胶质细胞/巨噬细胞极化在SCI-NP 形成中的作用及其可能机制。

方 法

1.实验动物

SPF 级健康SD 大鼠，雄性，6～7 周龄，体重210～260 g，由济南朋悦实验繁育有限公司提供[许可证号：SCXK（鲁）20190003]。所有实验大鼠饲养于室温25±1℃、湿度45%±5%、昼夜周期为12 h 的鼠房中，大鼠可自由地进食水。所有动物饲养和实验操作程序已通过山东大学附属省立医院实验动物伦理委员会批准（伦理批号：NSFC: NO.2019- 202）。

2. 主要实验药物及试剂

Bay 60-7550 (CAS No.:439083-90-6)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)购自美国Med Chem Express 公司。免疫组化一抗PDE2A 购于武汉三鹰生物技术有限公司，山羊抗兔二抗购于山东思科捷生物技术有限公司。PCR 引物：PDE2A、CD86(cluster of differentiation 86)、CD163 (cluster of differentiation 163)、IL-6 (interleukin 6)、IL-1β (interleukin 1β)、IL-10 (interleukin 10)、TGF-β (Transforming Growth Factor-β)委托上海博尚生物公司合成，Trizol RNA提取试剂盒 (AG21102)、Evo M-MLV 反转录试剂预混液(AG1172)、Pro Taq HS SYBR Green 预混qPCR试剂盒 (AG11701) 均购自湖南艾科瑞生物公司。流式细胞术应用抗体Granulocyte-FITC (clone HIS48)，Major Histocompatibility Complex II-PerCP-eFluor 710 (MHCII-PerCP-eFluor 710)(clone OX17) 和CD11b/c-eFluor 660 (clone OX42) 均购自美国eBioscience 公司，CD172a-PE (clone OX41) 购自美国BioLegend 公司。

3. 实验分组

根据既往研究[13]，通过预实验探索鞘内注射Bay 60-7550 的有效浓度。预实验中将大鼠随机分为3 组（每组3 只）：溶媒组（vehicle 组）、给药组（Bay 60-7550 0.1 mg/kg 组和Bay 60-7550 1 mg/kg 组）。根据预实验结果，正式实验大鼠随机分为4 组（每组共24 只大鼠，每组取3～5 只分别用于分子生物学及行为学检测）：假手术组（Sham 组）、模型组（SCI 组）、给药组（Bay 60-7550 组）和溶媒组（vehicle 组）。Sham 组：仅切除椎板、鞘内置管而不损伤脊髓；SCI 组：建立大鼠脊髓损伤模型并鞘内置管；vehicle 组：脊髓损伤大鼠鞘内注射10 μl 10% DMSO（溶解Bay 60-7550 粉末的溶媒组对照）；Bay 60-7550 组：脊髓损伤大鼠按照1 mg/kg 的浓度鞘内注射10 μl Bay 60-7550。

4. 建立脊髓损伤模型

采用改良Allen 法建立大鼠SCI 模型[14]。腹腔注射2%阿佛丁(10 ml/kg)麻醉大鼠，待大鼠无伤害刺激反应后俯卧位固定于手术板上。分别定位大鼠髋关节和最下肋骨，以定位点为中心向头尾两侧5 cm 范围备皮，消毒铺巾。首先，于大鼠背部以L5椎体为中心沿后正中线做约1 cm 纵行切口，应用聚乙烯套管(PE-10)经L5椎体下缘椎间隙垂直穿刺，将导管沿头侧端置入脊髓蛛网膜下腔，深度约0.5 cm，此时脑脊液可从鞘内导管流出。待大鼠麻醉恢复期，鞘内注射2%利多卡因10 μl，若出现双后肢拖拽行为或无力表现，则证明鞘内给药在合适的位置。应用3-0缝线将导管牢牢地固定于皮下并分层缝合切口。

然后，以T10椎体为中心向头、尾两侧做约3 cm纵行切口，分离肌腱和周边肌肉组织充分暴露T9～T11椎板棘突和椎板，取出切除的T10椎板及棘突，充分暴露相应节段的脊髓。将10 g 铁棒沿玻璃管从30 mm 高度垂直下落撞击脊髓，建立SCI 模型，术后充分止血缝合。术后每日1 次肌内注射青霉素20×104U，连续5 天预防感染。将大鼠放回干净温暖的笼内饲养恢复。此后每日人工排尿2 次(6:00～8:30 和16:30～18:00)，直至损伤大鼠可连续3 天自行排尿。

5. 鞘内注射给药

Bay 60-7550 溶液现用现配；给药前将Bay 60-7550 固体粉末溶解于10% DMSO 中，使溶液pH 值调整为7.4。预实验中，异氟醚麻醉下，Bay 60-7550 0.1 mg/kg 组经大鼠鞘内导管注射10 μl Bay 60-7550(0.1 mg/kg)；Bay 60-7550 1 mg/kg 组经鞘内导管注射10 μl Bay 60-7550 (1.0 mg/kg)；vehicle 组鞘内注射相同剂量的DMSO (10 μl)。正式实验中，异氟醚麻醉下，分别给Bay 60-7550 组及vehicle 组大鼠经鞘内导管注射Bay 60-7550 (1.0 mg/kg, 10 μl) 或DMSO(10 μl)。预实验和正式实验均于术后每日固定时间鞘内注射Bay 60-7550 或DMSO (10 μl/d) 1 次，持续1 周。

6. 机械痛阈评估

采用Chaplan 等[15]报道的机械痛阈评估方法来测量大鼠50%机械刺激缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)，每组随机分配5只大鼠。为避免主观误差，观察者隐瞒实验大鼠的分组情况。在正常光照和均匀噪声条件下，测量时间固定在上午8 点至12 点之间，同一观察者于术前、术后第7、10、14、17、21 天测定大鼠双后爪50% MWT，并取双后爪50% MWT 平均值。

具体测量方法如下：将大鼠放置于底部为金属网的透明玻璃箱内，使大鼠适应测试笼环境至少30 min，直至其探索活动消失。应用8 根vonFrey纤维丝（0.4 g、0.6 g、1.0g、2.0 g、 4.0 g、6.0 g、8.0 g、15.0 g，美国Stoelting 公司生产），按“Up-Down”的方法依序刺激大鼠后爪底部中央。首先，施加2.0 g 的纤维丝，持续刺激约6～8 s，观察大鼠是否出现快速缩足、舔足或摇晃反应，若出现则认定为阳性反应。在阳性反应情况下，标记结果为“X”，按顺序换用小一号的纤维丝。在阴性反应下，结果标记为“0”，并换用大一号的纤维丝刺激。当出现第1 次前后刺激反应变化后，继续测量4 次，结果序列用于计算50% MWT。50% MWT 的计算公式为：50% MWT = 10(Xf+κδ)（Xf 为最后一个vonFrey纤维丝力度值的对数，κ 为阳性/阴性反应序列的对应值，δ = 0.224）。为避免大鼠出现机械性痛觉敏化，每次刺激至少间隔2 min。

7. 免疫组织化学染色

术后第7 天，用1.2%阿佛丁(10 ml/kg)麻醉大鼠，行升主动脉插管，依次用0.9%氯化钠注射液200 ml 和4%多聚甲醛250 ml 进行心脏灌注，解剖分离T9～T10脊髓组织（每组3 只大鼠），置于4%多聚甲醛固定24 h。免疫组化操作按照Stephenson等[12]文献中描述的步骤。用距正中 (T9～T10) 尾侧1 mm 处相对完整的脊髓组织制备石蜡切片，厚度约为5 μm。切片经脱蜡、复水、抗原修复固定、洗涤和封闭后，与抗兔PDE2A 一抗(1:150, Cat. No.: 55306-1-AP) 在4℃孵育过夜，经磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline,PBS)洗涤后，将组织与山羊抗兔二抗 (1:200) 在室温下孵育40 min，接着用PBS 洗涤。使用DAB 试剂盒（山东思科捷生物技术有限公司）进行染色，并用苏木精进行复染。最后，使用奥林巴斯BX60 显微镜（ 奥林巴斯光学有限公司，日本东京）对染色的组织切片进行拍照。应用Image J 图像分析软件，根据光密度(optical density, OD)值计算图像中PDE2A 的阳性表达水平。

8. Western blot 检测

术后第7 天，麻醉灌注后分别取各组大鼠T9～T11节段的脊髓组织，置于液氮保存。脊髓组织称重在冰上剪碎，置于RIPA (radio-immunoprecipitation assay) 裂解缓冲液中匀浆提取蛋白质。根据说明书通过BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白质在7.5%分离胶上进行SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)电泳分离，后将其转移至PVDF (polyvinylidene fluoride)膜上置于5%脱脂牛奶中封闭2 h。封闭结束后将洗涤好的PVDF 膜置于一抗PDE2A 稀释液(1:1000,Cat. No.55306-1-AP) 中，4 ℃孵育，摇床过夜。TBST 洗涤后，置于抗兔HRP (horseradish peroxidase) 二抗(1:1000)室温孵育1.5 h。经TBST 洗涤3次（每次10 min）后，在膜上滴加ECL 显影液，于成像分析仪上显像。使用Image J分析各条带灰度值，PDE2A 与β-actin 灰度值的比值作为PDE2A 的相对表达量，每组数据以Sham 组作归一化处理。

9. 实时逆转录聚合酶链反应检测 (real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)

术后第7 天，分离大鼠T9～T11节段的脊髓组织，液氮保存。应用RNAex Pro 试剂提取脊髓组织中的RNA。参照试剂盒说明书要求，使用Evo M-MLV反转录预混型试剂盒将提取的RNA 逆转录为cDNA，然后用Pro Taq HS SYBR Green 预混qPCR 试剂盒进行PCR 扩增。最后，将扩增的PCR 应用瑞士Roche 公司的Light Cycler®480 II进行实时荧光定量PCR检测，分析Real-time PCR 扩增及溶解曲线，以内参GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 为对照，采用2-∆CT公式进行mRNA 相对表达量分析。GAPDH、M1 型小胶质细胞/巨噬细胞表面标记物CD86 及促炎因子：IL-6、IL-1β 和M2 型细胞表面标记物CD163 及抗炎因子：IL-10、TGF-β 的引物（见表1）。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

10. 流式细胞术

术后第7 天，大鼠在1.2%阿佛丁深麻醉下，心脏灌注PBS 后，分离T9～T11脊髓节段置于含5%胎牛血清的培养基（Gibco，赛默飞世尔科技公司）中，转移至4℃冰上进行后续操作；将脊髓组织剪成小碎块，加入与培养基等体积的0.25%胰蛋白酶液（不含EDTA，购自南京凯基生物科技发展有限公司）进行消化，15 min 后加入与胰蛋白酶溶液等体积的5%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)封闭，经75 μm 细胞滤器过滤制备单细胞悬液。密度梯度离心法分离单个核细胞[16]。离心后获得的单细胞悬液使用抗大鼠流式细胞术抗体：Granulocyte-FITC(0.25 μg/100 μl)、CD172a-PE (0.25 μg/100 μl)、MHCII-PerCP-eFluor 710 (0.25 μg/100 μl) 和CD11b/c-efluor 660 (0.125 μg/100 μl)染色30 min。用400 μl PBS 重悬细胞，应用流式细胞仪(LSRFortessaTM,BD, Cat.No.649225)采集单细胞并分析。通过Flow-Jo™ 10.4 软件 (BD) 进行数据分析。其中小胶质细胞/巨噬细胞被标记为CD11b/c+Granulocyt–、MHCII+CD172a–(M1型) 和CD172a+MHCII-(M2型) 亚型[17]。

11. 统计学分析

采用SPSS 24.0 软件 (IBM) 进行数据分析。所有结果以均数±标准误(±SEM)表示。通过Kolmogorov-Smirnov 检验分析数据是否符合正态分布。在行为学实验中，多组间比较采用重复测量方差分析和Turkey's post-hoc 分析。对于免疫组化、qRT-PCR 和流式细胞术比较，采用单因素方差分析，组间比较符合方差齐性时采用Turkey's post-hoc分析；若不符合方差齐性，则采用Tamhane's T2 post-hoc 分析。P< 0.05 认为差异有统计学意义。

结 果

1. Bay 60-7550 可减轻SCI 大鼠的机械性痛觉过敏

与Sham 组相比，SCI 组大鼠在术后7～21 天出现机械性痛觉过敏(P< 0.01)。同时，vehicle 组的50% MWT 显著低于Sham 组 (P< 0.01)。预实验结果显示，与vehicle 组相比，鞘内注射10 μl Bay 60-7550(0.1 mg/kg)对脊髓损伤大鼠的机械痛敏无明显缓解作用；而鞘内注射10 μl Bay 60-7550 (1 mg/kg)后大鼠机械痛阈值较vehicle 组明显提高（P< 0.01，见图1A）。因此，在正式实验中，鞘内注射1 mg/kg的Bay 60-7550 后，脊髓损伤大鼠的机械痛觉过敏在术后7～21 天明显减轻（P< 0.01，见图1B）。

图1 Bay 60-7550 对SCI 大鼠机械痛阈的影响 (±SEM)△△P < 0.01，与SCI + DMSO 组相比；**P < 0.01，与Sham 组相比；##P < 0.01, 与vehicle 组相比Fig. 1 Effects of Bay 60-7550 on mechanical pain threshold in SCI rats (±SEM)△△P < 0.01, compared with group SCI + DMSO; **P < 0.01, compared with group Sham; ##P < 0.01, compared with group vehicle.

2. Bay 60-7550 对SCI 大鼠脊髓PDE2A 表达的影响

免疫组化染色和Western blot 结果显示：术后第7 天，SCI 组和vehicle 组大鼠脊髓损伤区脊髓背角PDE2A 阳性表达强度及蛋白表达均高于Sham 组（P< 0.01，见图2A-K）。而Bay 60-7550 组脊髓背角PDE2A 表达低于vehicle 组（P< 0.05，见图2A-K）。

图2 Bay 60-7550 抑制SCI 大鼠PDE2A 的过表达(A-I: n = 3; J-K: n = 4,±SEM)(A-H)各组大鼠脊髓背角PDE2A 表达的免疫组化染色图；(I)各组大鼠脊髓背角免疫组化染色PDE2A 的平均光密度值；(J)免疫印迹法检测各组大鼠脊髓背角PDE2A 蛋白表达的代表性图像；(K)各组大鼠经β-肌动蛋白标准化后的蛋白表达变化统计图白色箭头标记为PDE2A 阳性表达；DH:脊髓背角；AOD:平均光密度值；Relative density ratio:相对密度比**P < 0.01，与Sham 组相比；#P < 0.05，与vehicle 组相比Fig. 2 Inhibition of PDE2A overexpression in SCI rats by Bay 60-7550 (A-I: n = 3; J-K: n = 4,±SEM)(A-H) Immunohistochemical staining images of PDE2A expression in the dorsal horn of the spinal cord in various groups of rats; (I) Average optical density values of immunohistochemical staining of PDE2A in the dorsal horn of the spinal cord of each group of rats; (J) Representative images of PDE2A protein expression in the dorsal horn of rat spinal cord in each group detected by Western blot; (K) The analyzed data normalized by β-actin in each group.White arrows show PDE2A positive expression; DH: spinal dorsal horn; AOD: average optical density**P < 0.01, compared with group Sham; #P < 0.05, compared with group vehicle.

3. Bay 60-7550 对大鼠脊髓损伤后巨噬细胞/小胶质细胞表型分化的影响

流式细胞术检测小胶质细胞/巨噬细胞比例（见图3A, 3B）；与Sham 组相比，SCI 组、vehicle 组大鼠脊髓组织中小胶质细胞/巨噬细胞M1/M2 亚型即MHCII+/CD172a-细胞的比例显著增加（P< 0.05，P< 0.01，见图3B）。而Bay 60-7550 组M1/M2 小胶质细胞/巨噬细胞比例低于SCI 组、vehicle 组（P<0.05，见图3B）。

4. Bay 60-7550 对M1、M2 型细胞相应炎症因子表达的影响

qRT-PCR 结果显示，与Sham 组相比，SCI 组和vehicle 组的M1 型标志物CD86 mRNA 表达显著增加 (P< 0.01)。与vehicle 组相比，Bay 60-7550 组M1 型标志物CD86 mRNA 表达显著降低（P< 0.01，见图4A）。而M2 型标志物CD163 mRNA 水平升高（P< 0.01，见图4B）。

图4 Bay 60-7550 对M1、M2 型细胞相应炎症因子表达的影响 (n = 3,±SEM)(A) qRT-PCR 检测各组大鼠脊髓组织中CD86 mRNA 表达的比较；(B) qRT-PCR 检测各组大鼠脊髓组织中CD163 mRNA 表达的比较；(C) qRT-PCR 检测各组大鼠脊髓组织中IL-6 mRNA 表达的比较；(D) qRT-PCR 检测各组大鼠脊髓组织中IL-1β mRNA 表达的比较；(E) qRT-PCR 检测各组大鼠脊髓组织中IL-10 mRNA 表达的比较；(F) qRT-PCR检测各组大鼠脊髓组织中TGF-β mRNA 表达的比较*P < 0.05，**P < 0.01，与Sham 组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，与vehicle 组相比Fig. 4 Effect of Bay 60-7550 on the expression of corresponding inflammatory factors of M1 and M2 (n = 3,±SEM)(A) Comparison of CD86 mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR; (B)Comparison of CD163 mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR; (C) Comparison of IL-6 mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR; (D) Comparison of IL-1β mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR; (E) Comparison of IL-10 mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR; (F) Comparison of TGF-β mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR.*P < 0.05，**P < 0.01, compared with group Sham; #P < 0.05, ##P < 0.01, compared with group vehicle.

与Sham 组相比，SCI 组和vehicle 组大鼠脊髓组织中IL-6、IL-1β mRNA水平均显著增加 (P< 0.01，P< 0.05)。与vehicle 组相比，Bay 60-7550 组鞘内给药后促炎因子IL-6、IL-1β mRNA 水平均显著减少（P< 0.01，P< 0.05；见图4C, 4D）。然而，与Sham 组相比，SCI 组大鼠脊髓组织中IL-10 mRNA水平无明显增加 (P> 0.05)，vehicle 组IL-10 mRNA水平增加 (P< 0.01)。与vehicle 组相比，Bay 60-7550组大鼠脊髓组织中IL-10 mRNA 水平显著性增加(P< 0.05)。与Sham 组相比，SCI 组和vehicle 组大鼠脊髓组织中M2 型抗炎细胞因子TGF-β mRNA 水平增加 (P< 0.01)。与vehicle 组相比，Bay 60-7550组大鼠脊髓组织中TGF-β mRNA 水平显著性增加（P< 0.05，见图4E, 4F）。

讨 论

脊髓损伤后神经病理性疼痛(SCI-NP)严重影响病人的日常生活，也给社会带来了沉重的经济和医疗负担。SCI-NP 涉及复杂的病理生理过程，包括神经炎症的级联反应、脊髓去抑制、下行疼痛调控通路中断、中枢敏化及神经元兴奋性增强[18]。因此，SCI-NP 的治疗十分困难，临床中仍缺乏有效的治疗方案。

PDE2A 是细胞内重要的信号调节因子，其广泛分布于外周和中枢神经系统[9]。Lakics 等[19]发现在多种哺乳动物的大脑和脊髓灰质中PDE2A 含量丰富，其中PDE2A 免疫染色密度最高的部位是脊髓背角神经元（尤其是I-II 层）的细胞核。随后，Kallenborn-Gerhardt 等[20]进一步发现，在酵母多糖诱导的小鼠足底炎性疼痛模型中，脊髓背角PDE2A表达上调，且PDE2A 免疫荧光标记与脊髓背角浅层神经元的标记重叠。PDEs 被证明可参与慢性炎症的产生，Rentsendorj 等[21]发现在小鼠急性肺损伤模型中抑制PDE2A 可增加上皮细胞cAMP、减少iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase) 来降低早期上皮细胞活化和渗漏，同时促进巨噬细胞iNOS 的增加，起到缓解炎性损伤的作用。Plummer 等[22]的研究显示，选择性PDE2A 抑制剂通过抑制cGMP水解可降低大鼠膝骨关节炎疼痛。我们既往的研究发现，PDE2A 在非压迫性腰椎间盘突出大鼠模型的脊髓背角中表达上调，而鞘内注射Bay 60-7550（0.1 mg/kg 或1 mg/kg）可减轻大鼠机械性痛觉过敏，降低脊髓后角中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平，产生抗炎和镇痛的效果，且具有剂量依赖效应[13]。本研究采用脊髓损伤大鼠模型，发现术后7～21 天模型大鼠产生明显的机械性痛觉过敏；且对术后7天大鼠损伤区尾侧脊髓背角进行免疫组化染色和Western blot 蛋白定量检测，发现SCI 大鼠脊髓背角PDE2A 免疫阳性水平和蛋白表达升高。我们推测SCI 大鼠脊髓背角PDE2A 的过表达可能与SCI-NP的产生有关。鞘内注射Bay 60-7550 (1 mg/kg) 1周后，脊髓损伤大鼠机械性痛觉超敏明显减轻，脊髓背角PDE2A 表达显著减少，脊髓组织中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6) 明显减少，且抗炎细胞因子 (IL-10、TGF-β) 明显升高。因此，推测鞘内注射PDE2A 选择性抑制剂Bay 60-7550 具有抑制SCI 大鼠脊髓背角中PDE2A 的表达，减轻脊髓背角神经炎症反应，缓解SCI 大鼠机械性痛觉超敏的作用。

众多研究表明，SCI 后脊髓背角神经元细胞内可发生许多分子信号变化，包括神经递质和生长因子的表达或释放，细胞内第二信使、细胞核转录因子的表达及蛋白激酶 (protein kinase A, PKA; protein kinase C, PKC)、细胞外信号调节激酶 (extracellular regulated protein kinases, ERK) 激活的细胞内信号通路等，对中枢敏化的产生具有重要作用[23]。PDE2A是调节细胞内第二信使的关键酶，这些证据表明PDE2A 在脊髓背角的分布及参与神经炎症反应的作用可能与中枢敏化的产生和调节有关。但PDE2A参与调节中枢敏化的具体机制尚不清楚。神经炎症在神经病理性疼痛的发病机制中起重要作用。Ji 等[24]提出脊髓神经炎症通过神经元-胶质细胞的相互作用可导致疼痛。脊髓损伤后单核细胞、胶质细胞等激活释放大量炎性物质，其中组织内驻留的小胶质细胞和血源性浸润的巨噬细胞大量聚集于损伤区域[25]。生理条件下，小胶质细胞处于M0 静止表型；脊髓损伤后由于局部微环境的改变，刺激小胶质细胞/巨噬细胞发生促炎（M1 型）或抗炎（M2 型）表型的极化，并以M1 型占优势，此时促炎与抗炎之间的平衡被打破[26]。M1 型小胶质细胞/巨噬细胞可释放促炎细胞因子和趋化因子加重神经炎症，并进一步激活小胶质细胞/巨噬细胞，从而形成炎症反应与小胶质细胞/巨噬细胞之间的正反馈级联环路，导致神经元过度兴奋[27]。因此，持续的神经炎症级联反应与小胶质细胞/巨噬细胞极化之间的反馈调节可能参与脊髓损伤后中枢敏化的形成。本研究发现，大鼠SCI 术后7 天流式细胞仪结果显示脊髓小胶质细胞/巨噬细胞大量激活，且以M1 表型为主，这一研究结果与报道一致[28]。

有研究表明，M1 型小胶质细胞的促炎作用介导了NP 的形成，而M2 型小胶质细胞的抗炎作用对NP 起到一定缓解作用，且NP 与M1/M2 小胶质细胞比例增加有关[29]。本研究结果发现SCI 大鼠鞘内注射Bay 60-7550 后7 天，流式细胞仪中小胶质细胞/巨噬细胞M1/M2 表型极化状态显著改变，M1 型细胞明显减少，M2 型细胞显著升高。同时本研究结果还显示，M2 表型标志物(CD163)的表达显著升高，抗炎细胞因子(IL-10、TGF-β)水平明显升高，机械性痛觉超敏缓解；相反，M1 型表面标记物 (CD86) 和促炎细胞因子(IL-1β、IL-6)生成减少。此外，Detloff 等[30]证明TNF-α 和IL-1β 参与了SCI 后机械性痛觉超敏的发展，而IL-6 参与了机械性痛觉超敏的维持。根据这些结果，可推测Bay 60-7550 可能参与驱动小胶质细胞/巨噬细胞从M1表型向M2 表型的转化，且具有抗炎和镇痛作用。

但本研究仅观察了鞘内注射Bay 60-7550 对SCI 大鼠机械性疼痛和小胶质细胞/巨噬细胞极化状态的影响，未阐明PDE2A 与中枢敏化的具体机制及Bay 60-7550 对细胞极化作用的可能机制。Bay 60-7550 对大鼠SCI 的恢复及运动改善情况仍需进一步实验设计进行探究。

综上所述，本研究证明了选择性PDE2A 抑制剂Bay 60-7550在大鼠SCI-NP模型中具有镇痛作用，并可调节小胶质细胞/巨噬细胞的极化，减轻神经炎症反应。因此，PDE2A 可能是减轻SCI 后神经病理性疼痛的潜在治疗靶点。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。