基于网络药理学和分子对接探讨大黄-三七配伍治疗脑出血机制及其实验验证

李艳娇,李双阳,唐红梅,白 雪

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是临床常见疾病,是全球范围内致死、致残的主要原因之一,2007—2017年,全球范围内脑出血住院人数增加18%,1990—2010年,全球脑出血发病率上升约47%[1]。发病后,高达50%～70%的存活病人中遗留有脑卒中后遗症,为全球医疗保健带来了沉重的负担[2]。目前,针对脑出血主要为西医治疗、中医治疗、中西医结合治疗,其中,以中西医结合治疗效果最佳。中医药具有多通路、多靶点、副作用少的特点,在临床上的应用较广泛[3]。脑出血在中医学归属于“中风”范畴,其病机主要涉及风、火、痰、瘀、虚,证型包括风火证、痰瘀证、气虚证、阴虚阳亢证等,其中,痰瘀论、火热论一直是众多医家的关注重点,故治疗多以活血化瘀、通腑泻热为主[4]。《神农本草经》记载:“大黄味苦,寒,无毒,主下瘀血,血闭,寒热,破癥瘕积聚,留饮,宿食,荡涤肠胃,推陈致新,通利水谷,调中化食,安和五脏。”言大黄具有清热泻火通腑、活血化瘀之效;《本草求真》记载:“三七,世人仅知功能止血住痛,殊不知因血瘀而痛作,血因敷散而血止。三七气味苦温,能于血分化而血瘀。”阐明三七具有化瘀止血、活血定痛之功。临床研究亦表明,大黄-三七药对可延缓脑出血后病理进展,显著提高病人治疗疗效,降低致残率、病死率[5-8]。故本研究拟运用网络药理学、分子对接的方法对大黄-三七配伍治疗脑出血的作用机制进行研究,为后续研究的开展提供依据。

1 资料与方法

1.1 网络药理学预测大黄-三七药对治疗脑出血作用机制

1.1.1 大黄、三七化合物与靶标的获取

通过中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分别查找大黄、三七,以口服生物利用度(oral bio-availability,OB)≥30%、类药性(drug likeness,DL)≥0.18为条件进行化合物筛选,并进行文献补充。

使用有机小分子生物活性数据库PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)对筛选后的活性成分进行对比确认后保存其蛋白的3D结构,对于PubChem未收录的成分通过Chemdraw绘制,并保存为3D格式。将以上成分的3D结构导入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库,物种限定为人“homo sapiens”,以可能性(probability)≥0筛选获得药物活性成分靶点,对于Swiss Target Prediction无靶点信息的成分通过TCMSP进行补充,并运用UniProt(https://www.uniprot.org/)获取靶标对应的基因名称。

1.1.2 脑出血疾病基因获取

以“cerebral hemorrhage”为关键词从人类基因综合数据库(https://www.genecards.org/,GeneCards)在线人类孟德尔遗传数据库(https://omim.org/,OMIM)、治疗靶点数据库(https://db.idrblab.net/ttd/,TTD)获取脑出血疾病基因,将检索出的疾病靶点进行整合、删选、去掉重复值,获得关于脑出血疾病相关靶点数据库。运用Venn工具获取药物活性成分-疾病交集靶点,所得的交集靶点即为大黄-三七有效活性成分可能作用于脑出血疾病的相关靶点。

1.1.3 构建“疾病-中药-化合物-交集基因”网络图

获取交集基因后,运用Cytoscape 3.7.1软件绘制“疾病-中药-化合物-交集基因”网络图,根据软件所提供的“network analyzer”板块进行网络拓扑学分析,依据度值和介度中心性,获得核心成分以及核心靶点。

1.1.4 蛋白-蛋白互作(PPI)网络的构建

将所得交集基因输入STRING(https://stringdb.org/)数据分析平台进行PPI分析,数据分析模式设定为“multiple proteins”,物种限制为“homo sapiens”。最低相互作用评分设置为高等置信度[medium confidence(0.900)],隐藏网络中无联系的节点,其余参数保持默认设置导出TSV文件。最后运用Cytoscape 3.7.1软件绘制PPI网络,使用软件所提供的“network analyzer”板块进行网络拓扑学分析,依据度值和介度中心性获得核心蛋白。

1.1.5 基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析

将交集基因导入Metascape数据平台(https://metascape.org/)进行富集分析,并对结果运用在线作图工具微生信(http://www.bioinformatics.com.com.cn/)行可视化转化。

1.2 动物实验验证

1.2.1 动物

选取无特定病原体(SPF)级SD雄性大鼠18只,鼠龄8～12周,体质量250～280 g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司,实验动物生产许可证:NO.SCXK(辽)2020-0001,由西南医科大学实验动物研究中心饲养,标准环境下饲养,实验温度20～24 ℃,湿度30%～40%,投以普通大鼠饲料,自由摄食以及饮水。

1.2.2 药物制备

三七、生大黄购于西南医科大学附属中医医院中药房,取生大黄与三七,分别研细末,过中药六号筛后,按生大黄、三七7∶3比例混合制得大黄三七散,用生理盐水将大黄三七散制成20 mg/mL的浓缩液。

1.2.3 主要试剂

Ⅶ-S胶原酶(Sigma公司);骨蜡(美国强生公司);兔抗磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)单隆抗体(Abcam公司);兔抗磷酸化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(p-AKT1)单隆抗体(Cell Signaling公司);兔抗丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)单隆抗体(碧云天公司);兔抗Bcl-2家族抗凋亡蛋白(Bcl xL)单克隆抗体(碧云天公司)、兔抗Bax单克隆抗体(碧云天公司);过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(BioX公司);逆转录试剂盒(UE公司);实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂盒(UE公司);苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(碧云天公司);原位末端转移酶标记技术(TUNEL)试剂盒(碧云天公司)。

1.2.4 主要仪器与设备

大鼠脑立体定位仪(北京众实迪创科技发展有限责任公司);BY-400C低速离心机(北京白洋医疗器械有限公司);SLFAD自动酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);-80 ℃超低温冰箱(美国赛默飞世尔公司);IMS-40全自动雪花制冰机(常熟市雪珂电器有限责任公司);DYY-10C电泳仪(北京六一仪器厂);ChemiDoc XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司);Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)。

1.2.5 造模及模型评估

大鼠称重后以1 mL/kg剂量腹腔注射3%戊巴比妥进行麻醉,用脑立体定位仪将大鼠俯卧位固定鼠头,常规备皮及消毒后,沿头皮正中纵向切开约1 cm,用30%过氧化氢腐蚀骨膜使前囟及冠状缝充分暴露,调节定位仪X轴、Y轴坐标以定位尾壳核区域,使针尖垂直于矢状缝右侧3.0 mm、前囟前0.8 mm处,用三棱针在针尖下钻开颅骨,以颅骨外板为零点调节定位仪Z轴,进针深度为5.5 mm,以0.1 U/min匀速缓慢注入胶原酶0.5 U,留针约10 min后缓慢退针,用骨蜡将钻孔封闭,术后头皮常规缝合消毒。假手术组仅进针不注入胶原酶,术后按照Zea Longa 5分法[9]对大鼠进行神经功能评分,无神经功能缺损症状为0分;提尾倒挂使血肿对侧前肢紧贴胸壁或不能伸展为1分;行走时向一侧转圈追尾,且血肿对侧前肢长拖或蜷缩,或有上述1分症状伴轻推时瘫侧抵抗力减弱为2分;行走或站立时向血肿对侧倾倒为3分;意识障碍,不能行走为4分,评分为1～3分则认为造模成功,可纳入实验。

1.2.6 分组与给药

18只SD雄性大鼠适应性喂养2 d后,随机分为假手术组、模型组、中药组,每组6只,其中,假手术组仅开颅不注射胶原酶,模型组脑内注射胶原酶造模,以上两组术前30 min给予生理盐水2 mL灌胃1次,造模后每天使用生理盐水2 mL灌胃1次,连续灌胃4 d;中药组根据文献[10]于造模前30 min以60 mg/kg剂量予以大黄-三七散2 mL灌胃,并于造模后连续灌胃4 d。

1.2.7 标本采集

大鼠给药4 d后禁食12 h,称重后予以腹腔注射3%戊巴比妥至深度麻醉,右心耳生理盐水灌注后快速取出脑组织,切取出血侧大脑半球置于试管后迅速置于-80 ℃保存脑组织。

1.2.8 检测指标

1.2.8.1 神经功能评分

Zea Longa 5分法[9]对大鼠进行神经功能评分。

1.2.8.2 HE染色观察大鼠脑组织病理改变

石蜡切片脱蜡复水,苏木精进行染色10 min,自来水冲洗,盐酸乙醇分化10 s,自来水冲洗;伊红染色3 min,自来水冲洗;脱水、透明、中性树胶封片,晾干后观察血肿周围脑组织病理改变,拍照并保存。

1.2.8.3 TUNEL检测大鼠脑组织细胞凋亡水平

石蜡切片脱蜡复水;切片滴加蛋白酶K,37 ℃避光孵育30 min,磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤;加TUNEL检测液,37 ℃避光孵育60 min,PBS洗3次;dapi核染,避光孵育10 min,PBS洗3次;封片后观察,拍照并保存。

1.2.8.4 RT-qPCR检测大鼠脑组织中PI3K、AKT1、Bax、Bcl xL的mRNA表达水平

取-80 ℃脑组织,用Trizol法提取总RNA后,逆转录为cDNA,逆转录后按95 ℃ 5 min预变性,40个循环(变性95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 25 s)对PI3K、AKT1、Bax、Bcl xL进行RT-qPCR扩增,用荧光定量PCR仪进行常规溶解曲线分析测定CT值,以2-ΔΔCT的计算值作为相对表达水平。引物序列见表1。

表1 RNA引物序列

1.2.8.5 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测大鼠脑组织中PI3K、AKT1、p-AKT1、Bax、Bcl xL蛋白表达水平

取0.1 g脑组织加入细胞裂解液并提取蛋白,二喹啉甲酸法(BCA)测定蛋白浓度,取50 μg总蛋白进行凝胶电泳,转膜后,脱脂奶粉封闭处理1 h,分别加入PI3K(1∶1 000)、AKT1一抗(1∶1 000)、p-AKT一抗(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl xL(1∶1 000)、β-actin一抗(1∶1 000),4 ℃孵育过夜,二抗(1∶5 000)室温孵育1 h,洗涤后避光显影。

1.3 分子对接

将PPI获得的核心蛋白作为分子对接的潜在靶点,获得的潜在靶点分别与大黄-三七核心成分做分子对接。在TCMSP网站下载化合物的结构式(mol2格式),经AutoDuckTools(v1.5.6)加全氢、设置为配体、检测扭转键、选择扭转键,最终导出为“pdbqt”格式文件;利用药物综合数据库(http://www1.rcsb.org/,PDB)蛋白数据库获得潜在靶点结构的PDB格式文件,利用PyMol(v2.3.0)将潜在蛋白与原始配体分离并去除水分子,然后将处理后的蛋白经AutoDuckTools(v1.5.6)加全氢,设置为大分子,导出为“pdbqt”格式文件;使用AutoDuckTools(v1.5.6)对处理后的靶蛋白、化合物进行分子对接,对接结果使用PyMol(v2.3.0)进行可视化分析。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 大黄、三七化合物与靶标的获取

共获得大黄活性成分16个、三七活性成分8个,其中,含共有成分1个;参考文献[11-16]补充大黄、三七各4个活性成分,共获得31个活性成分。31个活性成分用Swiss Target进行靶点预测,其中,芦荟、大黄素和儿茶素无靶点信息,故通过TCMSP进行补充,靶点基因去重后共486个基因。详见表2。

表2 大黄、三七活性成分信息

2.2 脑出血疾病基因及药物共同基因获取

检索GeneCards、OMIM、TTD疾病数据库,获得关于脑出血靶点信息共3 870个,经筛选、整合、去重后获得靶点1 128个,与药物靶点对比后获得两者的交集基因130个。详见图1。

图1 “药物-疾病”靶点韦恩图

2.3 “疾病-药物-化合物-交集基因”网络图

利用Cytoscape 3.7.1绘制“疾病-药物-化合物-交集基因”网络图,共获得164个节点(包含130个靶点、31个活性成分、2个药物、1个疾病)与554条关系,以度值和介度中心性作为拓扑分析的主要参考依据,排名居前5位的中药活性成分分别是槲皮素、泽兰黄醇、食脂素、大黄素甲醚、大黄酚,这些可能是大黄-三七配伍治疗脑出血的关键成分;排名居前5位的靶点分别是雌激素受体1(ESR1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、Bcl2样蛋白1(BCL2L1)、血管内皮生长因子A(VEGFA),这些体现了中药治疗疾病多成分、多靶点的作用机制。详见图2。

图2 “疾病-药物-化合物-交集基因”网络图

2.4 PPI网络的构建

将所得交集基因输入STRING数据分析平台,进行蛋白相互作用分析后,再用Cytoscape 3.7.1软件绘制PPI图。网络图中包含112个节点、491条边,图中圆形节点代表每个基因蛋白,边代表连接的2个蛋白有相互作用关系。按照度值、介度中心性作为拓扑分析的主要参考依据,获得互作关系排名前7位的蛋白分别为信号转导激活转录因子3(STAT3)、酪氨酸激酶(SRC)、丝裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、肿瘤蛋白p53(TP53)、磷脂酰肌醇3激酶α亚单位(PI3KCA)、Harvey肉瘤病毒癌基因同源物(HRAS)、AKT1。详见图3。

图3 PPI网络图

2.5 GO富集以及KEGG通路富集分析结果

运用Metascape进行GO富集分析后共获得符合筛选标准的条目2 137条,其中,分子功能(molecular function,MF)157条、生物过程(biological process,BP)1 835条、细胞组分(cellular component,CC)145条,选取富集结果排名前10位的条目进行可视化分析,图中Y轴代表P以10为底的负对数,Y轴越高,所对应的P值越小,其中,MF主要涉及与酶、蛋白、受体结合等;BP主要包括细胞迁移以及细胞成分运动的正向调节、细胞对氮化合物的反应、转移酶、激酶活性的正向调节等。详见图4。

图4 GO富集分析结果

运用Metascape进行KEGG分析,共获得符合筛选标准的条目188条,选取富集结果排名前20位的条目进行可视化,图中气泡代表富集的基因数,颜色代表P以10为底的负对数,颜色越深,所对应的P值越小。与脑出血相关的涉及PI3K/AKT信号通路、Rap1信号通路、晚期糖基化终产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路等。将前20条通路及对应交集基因导入Cytoscape进行可视化分析,靶点在PI3K/AKT信号通路、Rap1信号通路、MAPK信号通路富集的较多,较多通路涉及靶点AKT1、PI3KCA、MAPK1、HRAS。详见图5、图6。

图5 KEGG富集分析

图6 通路-靶点图

2.6 实验验证结果

2.6.1 神经功能评分

与假手术组比较,模型组大鼠给药4 d后神经功能评分明显升高(P<0.001);与模型组比较,中药组大鼠神经功能评分明显降低(P<0.01),表明大黄-三七药对可有效改善脑出血大鼠的神经功能评分。详见图7。

图7 各组大鼠神经功能评分结果 (n=6)(假手术组与模型组比较,＊ P<0.001;模型组与中药组比较,# P<0.01)

2.6.2 脑血肿面积

假手术组大鼠脑组织无明显血肿,与假手术组比较,模型组大鼠脑组织出现较大面积血肿,与模型组比较,中药组大鼠血肿面积明显缩小。详见图8。

图8 各组大鼠脑出血4 d后血肿面积变化(n=3)

2.6.3 HE染色

假手术组大鼠脑组织未见明显病理改变;模型组大鼠脑组织可见局部坏死、出血,神经元变性、水肿以及炎性细胞浸润等病理变化,与模型组比较,中药组大鼠脑组织病理损害程度明显减轻。详见图9。

图9 HE染色结果

2.6.4 TUNEL荧光染色

与假手术组比较,模型组大鼠脑组织凋亡细胞明显增多(P<0.01),与模型组比较,中药组大鼠脑组织凋亡细胞明显减少(P<0.05)。详见图10、图11。

图10 TUNEL荧光染色结果(×200)

图11 各组大鼠细胞凋亡率比较(n=3)

2.6.5 各组大鼠脑组织PI3K、AKT1、Bax、Bcl xL mRNA表达水平比较

与假手术组比较,模型组大鼠脑组织PI3K、AKT1、Bcl xL mRNA表达水平明显降低,Bax mRNA表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,中药组大鼠脑组织PI3K、AKT1、Bcl xL mRNA表达水平升高,Bax mRNA水平明显降低(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠脑组织PI3K、AKT1、P-AKT1、Bax、Bcl xL mRNA表达水平比较(±s)

2.6.6 各组大鼠脑组织PI3K、AKT1、p-AKT1、Bax、Bcl xL蛋白表达水平比较

与假手术组比较,模型组大鼠脑组织PI3K、p-AKT1、Bcl xL蛋白表达水平明显降低,Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,中药组大鼠脑组织PI3K、p-AKT1、Bcl xL蛋白表达水平升高,Bax蛋白水平明显降低(P<0.05)。说明大黄-三七药对可提高脑出血大鼠脑组织PI3K、AKT1以及抗凋亡蛋白Bcl xL蛋白表达水平,降低促凋亡蛋白Bax蛋白表达水平,通过激活PI3K/AKT通路,减少神经元凋亡,从而保护脑组织。详见表4、图12。

图12 各组大鼠脑组织PI3K、p-AKT1、AKT1、Bcl xL、Bax蛋白表达条带图

表4 各组大鼠脑组织PI3K、AKT1、p-AKT1、Bax、Bcl xL蛋白表达水平比较(±s)

2.7 分子对接结果

将核心成分与潜在靶点使用AutoDuckTools(v1.5.6)进行分子对接,该软件通过结合能评估配体与受体的结合能力,即计算最低结合能,<-17.78 kJ/mol代表有一定的结合力,<-20.92 kJ/mol代表两者结合性较好,<-29.29 kJ/mol代表两者有强烈结合。结果显示,核心成分与潜在靶点大部分均能较好结合。详见表5、图13。

表5 分子对接结果 单位:kJ/mol

3 讨 论

脑出血病理过程复杂,主要涉及发病早期血肿直接压迫造成的原发性损伤以及后期血脑屏障破坏、脑水肿形成造成的继发性脑损伤,涉及的机制包括小胶质细胞活化、炎症反应和氧化应激、细胞自噬与凋亡、神经兴奋性毒性、Ca2+离子超载、铁沉积等[17-18]。脑出血中医病机多为本虚标实证,本虚多因肝肾阴亏,气血不足;标实多为风火痰瘀,相兼为患,一旦发病,则气血逆乱,上冲于脑,痰瘀互结,腑气不通,其腑实与血瘀是重点。中医理论认为离经之血便为瘀血。因此,尽管脑出血有出血症状,依据中医理论亦当活血化瘀,治疗上以化瘀通腑为要。而大黄能够通腑泻热、荡涤肠胃、活血化瘀,为通腑之要药。《医学衷中参西录》言:“三七……善化瘀血,又善止血妄行,为血衄要药。病愈后不至瘀血留于经络……化瘀血不伤新血,允为理血妙品”。因此,治疗出血性脑卒中,医家多用大黄-三七配伍,因大黄能破瘀通腑,化瘀而不伤正,三七止血化瘀,活血止痛,止血而不留瘀,一通一涩,达到不止血而血自止的目的。

临床上,大黄-三七配伍治疗脑出血取得了一定的进展,现代研究表明,大黄-三七药对可通过保护血脑屏障、降低脑水肿、减轻炎症反应、抗氧化、抗凋亡等途径保护脑组织,从而改善神经功能,减轻认知障碍[19-21]。但大黄-三七药对治疗脑出血的具体作用机制研究较少,故本研究基于网络药理学的方法,利用相应的数据库和软件,构建了网络并对靶点进行了通路富集分析,初步挖掘和分析了大黄-三七配伍可能的作用机制,为临床使用大黄-三七配伍治疗脑出血提供更多依据。

3.1 药物活性成分分析

研究提示,大黄-三七配伍治疗脑出血中关键活性成分有槲皮素、泽兰黄醇、食脂素、大黄素甲醚、大黄酚等。多项研究表示,槲皮素具有显著的神经相关益处,与其强大的抗炎抗氧化作用相关[22];动物实验证明,槲皮素可显著降低脑出血小鼠大脑炎性因子白介素1β(IL-1β)、白介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及促凋亡相关蛋白Bax表达,通过抑制炎症反应和减少神经元凋亡,促进神经功能恢复[23-24]。黄酮类化合物大黄素甲醚具有广泛药理作用,现代研究多集中在缺血缺氧、脑缺血再灌注等脑损伤的神经保护作用的研究,其保护机制可能是通过降低IL-1β、TNF-α等炎性因子以及抑制细胞间黏附分子-1、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)、一氧化氮合酶等促凋亡蛋白基因的表达发挥作用[25-26]。研究显示,大黄酚可通过调控核因子κB(NF-κB)、MAPK、PI3K/AKT等信号通路发挥抗炎、抗神经元凋亡等作用以减少脑出血后神经元的损伤[27]。其他关键成分泽兰黄醇、食脂素现代药理学研究较少,可作为今后探索的切入点。

3.2 关键靶点及通路生物进程分析

通过蛋白质相互作用分析,获得关键靶点STAT3、SRC、MAPK1、TP53、PIK3CA、HRAS、AKT1。通过KEGG信号通路分析,发现与脑出血密切相关的通路有PI3K/AKT信号通路、Rap1信号通路、AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路等。STAT3是一种蛋白质编码基因,通过调节相关通路,有效改善脑出血后炎症反应以及氧化应激、减轻神经细胞凋亡、促进血管生成等作用,成为神经系统重要的保护因子[28];SRC家族激酶广泛存在于神经元和胶质细胞中,与调节增殖、血管生成、侵袭转移以及骨代谢等过程相关,既往研究显示,SRC磷酸化通过旁细胞途径增加微血管通透性,参与血脑屏障损害后病理性通透性过程,抑制SRC活性能,有效保护血脑屏障,减轻脑水肿,改善神经功能损伤[29];AKT参与细胞凋亡、增殖、血管新生等过程[30],包括AKT1、AKT2、AKT3亚型,AKT1主要存在于内皮细胞,与调节细胞代谢、增殖、细胞存活、血管新生以及维持血管完整度紧密相关[31],PI3KCA是PI3K的催化亚基,可激活PI3K/AKT信号通路[32]。研究显示,脑组织中PI3K/AKT信号通路通过调控血管生成基因表达以及抑制神经元凋亡实现脑保护[33-34]。脑出血后,机体本身可以释放能够将具有酪氨酸激酶活性受体激活的物质如神经细胞生长因子,受体经过其磷酸化后可特异性的结合PI3K的调节亚基,从而将PI3K激活,AKT作为PI3K的下游效应因子,与PI3K结合后使发生磷酸化而激活,活化后的AKT可调控凋亡相关蛋白如Bax、Bcl xL以及血管生成因子表达,通过抗神经元凋亡以及促进血管新生保护脑组织[35]。

3.3 分子对接及实验验证结果分析

分子对接结果显示,大黄-三七药物核心成分与筛选出的关键靶点大部分能较好地结合,体现了中医药多靶点、多通路的治疗特点。本研究动物实验显示,大黄-三七药对可有效降低脑出血大鼠神经功能评分,减小血肿面积,改善脑组织病理损伤,升高脑出血大鼠脑组织PI3K、AKT1、Bcl xl表达,降低Bax表达,通过激活PI3K/AKT通路发挥抗凋亡作用,从而保护脑组织,改善神经功能缺损。

综上所述,大黄-三七配伍治疗脑出血的主要成分可能有槲皮素、泽兰黄醇、食脂素、大黄素甲醚、大黄酚,关键靶点蛋白主要有STAT3、SRC、MAPK1、TP53、PIK3CA、HRAS、AKT1,涉及的信号通路有PI3K/AKT信号通路、Rap1信号通路、AGE-RAGE 信号通路、MAPK信号通路,提示大黄-三七药对治疗脑出血可能与抗神经细胞凋亡、抑制炎症反应、促进血管新生等多个生物学过程有关,分子对接和动物实验结果也进一步验证了成分与靶点的相互作用,体现了中医药多成分、多靶点、多通路的特点,对阐明大黄-三七配伍治疗脑出血的作用机制具有一定借鉴意义,但动物实验验证所选样本量较少,所得结论仍需进一步实验或临床验证。