秋葵嫩荚提取液体外清除亚硝酸盐的研究

陈 菊

（黔东南民族职业技术学院，贵州凯里 556000）

亚硝酸盐是一种常用的食品添加剂，可以使食品的存储时间得以延长。但亚硝酸盐具有较强的毒性，如果人体摄入过量就会出现昏迷、抽搐、呼吸麻痹、损害心脏功能、导致休克等危害[1]；另一方面，亚硝酸盐在人体胃酸环境下会进行亚硝化反应生成亚硝胺，亚硝胺是一种强致癌物质，能诱发人体和动物的多种脏器官生成恶性肿瘤[2]。由于目前还没有找到能完全代替亚硝酸盐的替代物，因此要想办法尽可能减少食品中亚硝酸盐的含量，降低人们因从食物中摄入过量亚硝酸盐带来的危害。据研究表明[3-6]，各种新鲜蔬菜、水果等天然植物中的酚类、黄酮类、多糖类及维生素等活性物质均具有一定程度清除亚硝酸盐的作用。

秋葵为锦葵科秋葵属一年生草本植物，又称羊角豆、洋辣椒。其花、嫩果荚、种子均可食用，是一种营养价值较高的药食同源植物，被许多国家运动员作为首选的蔬菜。秋葵嫩荚肉质柔嫩，富含维生素、果胶、糖类、酚类、黄酮等多种生物活性成分，具有抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、保护肠胃、提高人体免疫力及保护心血管系统等生理功能[7-10]，是生产保健食品的重要来源，但目前对秋葵产品的加工仍处于初级阶段，其中营养活性成分的开发利用还不够深入。为进一步提高秋葵利用价值，以秋葵嫩荚为试验对象，在模拟人体胃液条件下，通过单因素试验和正交试验研究确定秋葵清除亚硝酸盐的最佳条件，为开发秋葵作为天然亚硝酸盐清除剂提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 仪器设备

722 型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司产品；离心机，上海梅香仪器有限公司产品；多功能粉粹机，永康市铂欧五金制品有限公司产品；分析天平，梅特勒托利多（上海）仪器有限公司产品；SK8200HP 型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司产品；101 型电热鼓风恒温干燥箱，上海双旭仪器有限公司产品；HH-W420 型数显恒温三用水箱，常州市顶新实验仪器有限公司产品。

1.1.2 主要试剂

秋葵嫩果，购自凯里市农贸市场；抗坏血酸（AR）、胃蛋白酶（酶活力3 000 U/g），上海源叶生物有限公司提供；无水乙醇、甲醇、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、浓盐酸等试剂均为国产分析纯；蒸馏水：实验室自制。

模拟人体胃液的制备：称取2.0 g NaCl 和胃蛋白酶3.2 g，分别加蒸馏水溶解后再加入7 mL 浓盐酸，用蒸馏水定容至1 000 mL 容量瓶中。

1.2 试验方法

1.2.1 秋葵提取液制备

取适量秋葵嫩果于65 ℃烘箱内烘干，粉碎后，过40 目筛。准确称取2.00 g 秋葵样品，置于具塞三角瓶中，加入60 mL 的提取溶剂，浸泡30 min，于50 ℃条件下进行超声提取30 min，提取2 次，合并溶液，室温冷却后，以转速3 000 r/min 离心10 min，收集上清液于棕色瓶中，于4 ℃冰箱中冷藏备用。

1.2.2 亚硝酸盐清除率的测定

参考文献[11-12]，采用盐酸萘乙二胺比色法测定亚硝酸盐清除率，秋葵果荚中有效成分能够与亚硝酸钠作用消耗亚硝酸根，通过测定溶液吸光度，计算亚硝酸盐清除率。取25 mL 具塞比色管，均加入模拟胃液10.0 mL，在37 ℃水浴条件下保温10 min，加入一定体积的秋葵提取液，再加入质量浓度为5.0 μg/mL 的NaNO2溶液2.0 mL，摇匀，置于37 ℃水浴中反应一定时间后取出，立即加入质量分数为0.4%的对氨基苯磺酸2.0 mL，混匀，静置5 min 后，加入质量分数为0.2%的盐酸萘乙二胺溶液1.0 mL，再静置15 min，加蒸馏水至刻度，充分摇匀。于波长538 nm 处测定吸光度A1，同时做以蒸馏水替代秋葵提取液的空白对照试验并测定吸光度A2，以蒸馏水替代NaNO2溶液的空白对照试验测吸光度A3，试验重复3 次，按下式计算秋葵提取液对亚硝酸盐的清除率。

式中：A1——样品的吸光度；

A2——蒸馏水代替秋葵溶液空白对照的吸光度；

A3——蒸馏水代替NaNO2溶液空白对照的吸光度。

1.2.3 单因素试验设计

不同提取溶剂对亚硝酸盐的清除率：准确称取2.00 g 秋葵样品，分别置于7 个具塞三角瓶中，依次加入60 mL 的蒸馏水、60%甲醇及不同体积分数的乙醇溶液：45%，55%，65%，75%，85%，按照“1.2.1”方法制备提取液。按照“1.2.2”方法，取2.5 mL 秋葵提取液，分别加入NaNO2溶液，37 ℃水浴中反应90 min 后，测定不同溶剂提取液对亚硝酸盐的清除率。

提取液不同用量对亚硝酸盐的清除率：准确称取2.00 g 秋葵样品，加入60 mL 体积分数为65%的乙醇溶液，按照“1.2.1”方法制备提取液。分别吸取秋葵提取液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，再各加入NaNO2溶液，对氨基苯磺酸和盐酸萘乙二胺溶液，按照“1.2.2”方法，测定亚硝酸盐的清除率。

不同反应时间对亚硝酸盐的清除率：分别吸取秋葵提取液2.5 mL（65%的乙醇作提取剂），各加入NaNO2溶液2.0 mL，37 ℃水浴中分别反应20，40，60，80，100，120，150 min，按照“1.2.2”方法，测定亚硝酸盐的清除率。

不同pH 值对亚硝酸盐的清除率：取7 支具塞比色管，分别加入pH 值为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 模拟胃液10 mL，加入2.5 mL 秋葵提取液（65%的乙醇作提取剂）与NaNO2溶液2.0 mL于37 ℃水浴中90 min，按照“1.2.2”方法，测定亚硝酸盐的清除率。

1.2.4 正交试验设计

根据单因素试验结果，选择各影响因素提取溶剂（A）、提取液用量（B）、反应时间（C）、pH 值（D）的最佳处理条件，按照L9（34）进行四因素三水平的正交试验研究，优选秋葵提取液清除亚硝酸盐的最优条件。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.2.5 数据分析

试验中的数据均是3 次重复试验的平均值，采用Excel 软件作图和分析处理。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂对亚硝酸盐清除率的影响

提取溶剂对亚硝酸盐清除率的影响见图1。

图1 提取溶剂对亚硝酸盐清除率的影响

由图1 可知，提取溶剂不同对亚硝酸盐的清除效果有差异，清除能力最弱的提取溶剂是甲醇，清除能力最强的提取溶剂是乙醇，且清除能力随着乙醇体积分数的增大呈增强趋势，这表明秋葵清除亚硝酸盐的有效成分更易溶于乙醇溶剂中。当乙醇体积分数达65%时清除率最大，继续增加体积分数，对清除率的贡献不再增加反而降低。考虑成本，后续试验选用体积分数为65%的乙醇溶液作提取溶剂。

2.2 提取液用量对亚硝酸盐清除率的影响

提取液用量对亚硝酸盐清除率的影响见图2。

图2 提取液用量对亚硝酸盐清除率的影响

由图2 可知，当秋葵提取液用量为0.5～2.5 mL，提取液对亚硝酸盐的清除率随用量的增加而升高，当提取液用量为2.5 mL 时清除效果最好，说明提取液中的活性成分已把可以清除的亚硝酸盐清除完全，再增加用量已无法提高清除率。因此，选择秋葵提取液的用量为2.5 mL。

2.3 反应时间对亚硝酸盐清除率的影响

反应时间对亚硝酸盐清除率的影响见图3。

图3 反应时间对亚硝酸盐清除率的影响

由图3 可知，秋葵提取液与亚硝酸盐的反应时间为20～100 min，清除率与反应时间呈正比，100 min后，随着时间的延长，清除率开始下降。同时，由图3 可知，反应时间为60～100 min 时的曲线较平滑，清除率表现较缓慢，表明提取液对亚硝酸盐的清除反应已逐渐达到平衡状态。为确定秋葵提取液与亚硝酸盐的最适宜反应时间，宜选择反应时间为60～120 min 进行正交试验。

2.4 pH 值对亚硝酸盐清除率的影响

pH 值对亚硝酸盐清除率的影响见图4。

图4 pH 值对亚硝酸盐清除率的影响

由图4 可知，随着pH 值的降低，亚硝酸盐清除率逐渐升高。当pH 值为1.5 时，清除率最高，结合人体胃酸pH 值为1.2～3.0，选择模拟胃液pH 值为1.0～2.0 进行优化试验。

2.5 正交试验分析

秋葵提取液清除亚硝酸盐正交试验结果及直观分析见表2，秋葵提取液清除亚硝酸盐的方差分析见表3。

表2 秋葵提取液清除亚硝酸盐正交试验结果及直观分析

表3 秋葵提取液清除亚硝酸盐的方差分析

以清除率为评价指标，对秋葵提取液清除亚硝酸盐的正交试验结果进行直观分析和方差分析，由直观分析可知，提取溶剂、提取液用量、反应时间、pH 值这4 个因素对秋葵提取液清除亚硝酸盐效果均有一定程度的影响，其中影响最大的因素是提取液用量，因素pH 值的影响最小，4 个因素影响程度由高到底依次为提取液用量、反应时间、提取溶剂、pH 值。而且由表3 方差分析可知，4 个影响因素中除因素pH 值影响不显著外，其他3 个影响因素对亚硝酸盐清除效果的影响程度均达显著水平。由此确定秋葵提取液清除亚硝酸盐的最优条件为A2B2C2D3，即提取溶剂为65%的乙醇，提取液用量为2.5 mL，反应时间为1.5 h，pH 值为2.0。不在正交试验设计的方案中，需要做验证试验。因此，准确称取2.00 g 预处理后的秋葵样品，在该条件下进行试验，重复3 次，求得亚硝酸盐清除率为90.99%，表明此方案可行。

2.6 秋葵提取液与抗坏血酸（维C）清除亚硝酸盐能力的比较研究

维C 具有较强的抗氧化性，对亚硝酸盐有明显的清除作用[13]。因此，以维C 为阳性对照，考查质量浓度为0.08～0.40 mg/mL 时的秋葵提取液分别在pH值2.0 的模拟胃液条件下反应1.5 h 对亚硝酸盐的清除率。

秋葵提取液与维C 对亚硝酸盐的清除作用见图5。

图5 秋葵提取液与维C 对亚硝酸盐的清除作用

由图5 可知，两者对亚硝酸盐的清除率随着质量浓度的增加而增加，在相同质量浓度条件下秋葵提取液对亚硝酸盐的清除能力大于抗坏血酸，在低质量浓度条件下两者的清除能力区别较大。说明秋葵体液对亚硝酸盐有明显的清除作用。

3 结论

近年来，有关天然植物提取物被证明为有效亚硝酸盐清除剂的研究逐渐增多。曹楚珩等人[14]研究表明，大蒜浸提液对腌制咸鱼中亚硝酸盐具有清除作用。付丽等人[15]研究表明，八角、桂皮、生姜提取液均对亚硝酸盐的清除有着较好的效果。汪洪涛[16]研究发现，罗汉果花提取液对亚硝酸盐清除率可达56.83%。李米等人[17]的研究也表明，生姜中的姜辣素可作为一种高效、安全的亚硝酸盐清除剂被利用。

有研究表明，秋葵提取液对亚硝酸盐具有清除作用。试验从提取溶剂、提取液用量、反应时间、pH 值4 个单因素对秋葵提取液清除亚硝酸盐能力的影响进行了考查，并结合正交试验对影响因素进行优化，得出秋葵提取液清除亚硝酸盐的最佳条件为选用体积分数为65%的乙醇为提取溶剂，提取液用量2.5 mL，反应时间1.5 h，pH 值2.0，测得亚硝酸盐清除率为90.99%。以维C 为阳性对照，在所考查的质量浓度范围内，秋葵提取液均能较好的清除亚硝酸盐，且效果高于维C。研究结果表明，秋葵嫩果具有较强的清除亚硝酸盐能力，是一种具有较大开发价值的天然植物。但由于秋葵中活性成分较多而复杂，有关秋葵清除亚硝酸盐各活性成分的含量及其与清除亚硝酸盐的关系还需进一步研究探讨。