槟榔中黄曲霉毒素B1 检测方法研究

肖晓义，袁 河

（湖南省槟榔加工与食用安全工程技术研究中心，湖南宾之郎食品科技有限公司检测中心，湖南湘潭 411201）

0 引言

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFT B1）是一种真菌毒素[1-2]。其耐热，难以从污染受体中祛除[3-4]。毒性、危害性在黄曲霉毒素中最强[5-6]，被列为I 级致癌物[7]，具有致癌、致畸和引起肝脏损伤的作用[8]。黄曲霉生长及产生毒素的最适条件是温度24～30 ℃，湿度80%[9]。槟榔是槟榔树的果实[10-11]，具有提神、抗疲劳的功效[12-13]。在我国，槟榔主产于海南，台湾、福建等地有少量种植[14-15]，主要加工于湖南[16]地区。每年的10—11 月是槟榔的成熟期[17]，湖南食用槟榔企业会在此时从海南及东南亚等地采购槟榔原果以供应全年甚至多年生产[18]，这说明槟榔烘干成原果后需要经过长路程、多环节的运输和长时间的储存。若运输与贮藏中的环境温湿度、槟榔水分含量等条件控制不当，极易发生霉变，进而产生黄曲霉毒素[19]，对后续工艺造成污染，产生食品安全风险。槟榔在我国各地都有食用[20]，分布广泛，槟榔发生任何食品安全事件都会产生广泛的影响，都将打击近年来发展迅速的国内槟榔产业[21]。

测定黄曲霉毒素的方法主要有高效液相色谱柱前衍生法、高效液相色谱柱后衍生法、高效液相色谱串联质谱法、酶联免疫吸附法、薄层色谱法等[22]。其中，高效液相色谱是最为常用的方法，高效液相色谱柱前衍生法相较于液相连用质谱，或者液相柱后衍生更具成本优势，但是也有精密度差、操作时间长的缺点。因此，以槟榔为样品优化了高效液相色谱柱前衍生法，提供了一种准确、简便、成本较低的槟榔中黄曲霉毒素B1的检测方法。该检测方法对保障槟榔的食品安全具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

槟榔，海南市售干果；食用槟榔，湘潭市售成品；正己烷、丙酮、三氟乙酸、乙酸乙酯（色谱纯），国药集团化学试剂有限公司提供；乙腈（色谱纯），美国TIDE 公司提供；HiCapt Aft 固相萃取柱，武汉维泰克公司提供；AFT B1标准品，纯度≥99.5%，坛墨质检标准物质中心提供。

1.1.2 仪器设备

悬浮架自身刚度很大，悬浮架的在xoz平面内运动形式为沿z向上下变化(移动值为b)以及与x轴产生倾角θ。

LC-20A 型高速液相色谱配荧光检测器，日本岛津公司产品；UV-2600 型紫外可见光分光光度计，日本岛津公司产品；WD-12 型氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司产品；KQ-700 型超声波清洗机，昆山美美仪器有限公司产品；LHS-250HC-II 型恒温恒湿培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配置与校准

(2)冷凝管中水流方向是“低进高出”,则③是进水口;冷凝管上连接的干燥管的作用有二:一是吸收逸出的Cl2、SO2,防止污染空气;二是防止空气中的水蒸气进入反应装置而使SOCl2水解。

式中：ρ——校准测定的AFT B1的试剂质量浓度，μg/mL；

A——在λmax的吸光度；

312——AFT B1的摩尔质量，g/mol；

20 700——乙腈的摩尔吸光系数，m2/mol。

1.2.2 样品前处理

将槟榔切片烘干后，用高速粉碎机粉碎，作为试样备用。称取2.5 g 试样于50 mL 离心管中，加入10 mL 乙腈，涡旋混匀，超声30 min，以转速4 000 r/min 离心10 min，取上清液作为提取液备用。

采用SPASS 18.0进行分析，计量资料用±s表示，采用t检验，两组间率的比较采用x2检验，P＜0.05提示差异有统计学意义。

1.2.3 净化

在黄曲霉专用柱中加入5 mL 丙酮，3 mL 正己烷进行活化[23]。活化后在黄曲霉专用柱中加入8 mL提取液，全部流出后用6 mL 乙酸乙酯/ 正己烷（1∶1）溶剂清洗，弃去清洗液，抽干净化柱。用8 mL 丙酮解析，作为净化液备用。

1.2.4 衍生

精确移取5 mL 净化液，50 ℃氮吹至干，分别加入2 mL 正己烷和100 μL 三氟乙酸，涡旋混匀后，在恒温恒湿箱中40 ℃下反应15 min，结束后于50 ℃下氮吹至干，用质量分数为67%的乙腈溶液2 mL 定容，涡旋混匀1 min，过滤后待上机分析。

1.2.5 色谱条件

色谱柱：Agilent ZabarX C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；荧光检测器：激发波长384 nm，发射波长406 nm；柱温35 ℃，进样量10 μL；流动相：乙腈+水（67+33），流速1.0 mL/min。

正交试验因素与水平设计见表1。

（1）衍生反应正己烷的体积。将样品中AFT B1的含量加标至5 μg/kg。将处理后样品平均分成5 组，每组6 个平行，每个平行2.5 g，置于20 mL 离心管中，以料液比1∶4（g∶mL）乙腈，于40 ℃下超声提取30 min 制成提取液，经过净化后，取5 mL净化液氮吹至干，每组分别加入200，500，1 000，2 000，3 000 μL 正己烷和100 μL 三氟乙酸衍生，衍生完成后再次吹干，以2 mL 初始流动相复溶，上机检测，以提取率及其相对标准偏差选择衍生操作中加入的正己烷体积。

不同的应用场景其复杂程度以及碰撞模拟量均是不同的，针对本文的研究对象，如若用一般的包围盒，其精确度不符合要求，不能准确地描述对象，基于这点，考虑针对混合层次包围盒[6]的改进。

（2）提取溶剂。将样品中AFT B1的含量加标至5 μg/kg。将处理后样品平均分成5 组，每组3 个平行，每个平行2.5 g，置于20 mL 离心管中，以料液比1∶4（g∶mL）分别加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、氯仿[24-25]，于40 ℃下超声提取30 min 制成提取液，经过净化后，再取5 mL 净化液氮吹至干，加入2 000 μL 正己烷和100 μL 三氟乙酸衍生，衍生完成后再次吹干，以2 mL 初始流动相复溶，上机检测，以AFT B1的提取率选择提取溶剂。

（3）料液比。将样品中AFT B1的含量加标至5 μg/kg。将处理后样品平均分成5 组，每组3 个平行，每个平行2.5 g，置于20 mL 离心管中，分别以料液比1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6（g∶mL）加入乙腈溶液，于40 ℃下超声提取30 min，制成提取液，经过净化后，再取5 mL 净化液氮吹至干，加入2 000 μL 正己烷和100 μL三氟乙酸衍生后氮吹至干，用流动相2 mL 复溶后上机检测，以AFT B1的提取率选择料液比。

（4）净化。将样品中AFT B1的含量加标至5 μg/kg。将处理后样品平均分成2 组，每组3 个平行，每个平行2.5 g，置于20 mL 离心管中，以料液比1∶4（g∶mL）加入乙腈溶液，于40 ℃下超声提取30 min 制成提取液，经过净化后，再取5 mL净化液氮吹至干，加入2 000 μL正己烷和100 μL三氟乙酸衍生后，衍生完成后再次吹干，以2 mL 初始流动相复溶，上机检测，以AFT B1的提取率及分离程度取舍净化步骤。

1.2.7 单因素试验

在开张项目的施工过程中，其中最重要的一项任务就是防水施工环节，这也是预制装配式住宅项目进行的要点，我们需要根据预制装配式建筑本身的特征，有效深化地设计出能够对预制墙和预制板的防水性能，对关键性的防水环节要进行改良和优化。比如，预制装配式项目施工环节，空调板和叠合板的预埋件处理工作以及外挂墙板中的横的缝隙的处理工作，都需要进行防水环节的优化设计，这样才能保证项目质量的提升，保障项目施工环节能够有序进行。

由图5 可知，未经净化样品的色谱图中，目标峰周围无明显杂峰，分离定性定量效果良好，且样品经过净化后样品中的杂质并未见明显减少。综合图4，可发现净化后的样品检出率低于未净化的样品，说明净化步骤会造成样品中AFT B1的损失。因此，为了减少操作时间，节省使用净化柱的成本，提高AFT B1检出率，故对样品不采用净化操作。

由于工作需要，忻州分公司对业务部负责人进行了调整。走马上任后，曹淑英开展的第一项工作就是带领业务部深入基层进行全面细致的市场调研，对客户进行大量的拜访沟通。

（2）超声温度。将样品中AFT B1的含量加标至5 μg/kg。将处理后样品平均分成6 份，每份2.5 g，置于20 mL 离心管中，以料液比1∶4（g∶mL）加入乙腈溶液，分别在30，35，40，45，50，55 ℃下超声提取30 min，超声后取5 mL 提取液完成衍生步骤，上机检测。

称取1 mg AFT B1标准品于100 mL 容量瓶，用乙腈定容至刻度，制成标准储备液。使用分光光度计对标准储备液进行光谱测试，在最大吸收波长（λmax）读取标准储备液的吸光度A。校准溶液实际质量浓度计算公式如下：

（3）乙腈质量分数。将样品中AFT B1的含量加标至5 μg/kg。将处理后样品平均分成6 份，每份2.5 g，置于20 mL 离心管中，以料液比1∶4（g∶mL）分别加入75%，80%，85%，90%，95%，100%乙腈溶液，于40 ℃下超声提取30 min，超声后取5 mL 提取液完成衍生步骤，上机检测。

1.2.8 正交优化试验

在单因素试验结果的基础上，选择提取溶剂为85%乙腈，料液比1∶4，衍生操作中加入的正己烷体积2 000 μL，选取超声时间、超声温度、乙腈质量分数3 个因素设置表中因素水平，以空白的黄曲霉毒素加标样品为评价指标。

1.2.6 样品前处理条件改良

表1 正交试验因素与水平设计

1.3 数据处理

由于槟榔作为样品具有不均匀的特点，所以研究中的样品均经过加标处理，使AFT B1的含量为5 μL/kg 以避免误差。故评价方法优劣的检出率计算方式如下：

Wang等[3]使用蝙蝠算法(Bat Algorithm, BA)解决了无人战斗机(Uninhabited Combat Air Vehicle, UCAV)的二维路径优化问题，并通过实验与粒子群优化(Particle Swarm Optimization, PSO)算法等其他方法比较，验证了BA的有效性；Zhu等[4]提出使用自组织图和速度合成法对在水下工作区域内的无人潜艇进行三维路径规划，实现潜艇在海洋动态潮流下的任务路径最短；陈家照等[5]提出一种基于改进PSO算法的三维空间路径规划，通过PSO算法将三维路径规划问题转化为二维空间上的路径规划问题,从而解决飞行器的三维路径规划问题。

式中：X——提取率，%；

C1——样品中检出的AFT B1含量，μg/kg；

C2——样品加标后的理论AFT B1含量，为固定值5 μg/kg。

2 结果与分析

2.1 衍生中正己烷体积对精密度及提取率的影响

标准曲线见图9。

图1 正己烷体积对检出率的影响（n=6）

表2 正己烷体积对提取率及精密度的影响（n=6）

由表2 和图1 可知，随着正己烷体积的增加，RSD 值逐渐降低，提取率升高。当正己烷体积达到2 000 μL 时，RSD 值与提取率趋于稳定，不再有明显差异，分别为1.46%和70%。这可能是因为，作为三氟乙酸与AFT B1反应载体的正己烷体积在2 000 μL 以下时不能完全溶解吹干后的样品提取液，随着正己烷体积增加，提取液复溶更加完全，因此提取率逐渐升高，平行结果间离散程度变小。综上所述，衍生反应中使用的正己烷体积为2 000 μL。

2.2 不同溶剂对检出率的影响

不同提取溶剂对检出率的影响见图2。

图2 不同提取溶剂对检出率的影响

B 类黄曲霉素属于二氢呋喃香豆素衍生物，极性小[26]，因此难溶于水，易溶于有机溶剂。选用几种有报道的黄曲霉毒素提取溶剂[24-25]进行对比。从结果来看，提取率最高的为乙腈。因此，选择乙腈作为提取溶剂。

2.3 料液比对检出率的影响

料液比对检出率的影响见图3。

图3 料液比对检出率的影响

随着乙腈体积的增加，黄曲霉的提取率提高，当料液比1∶4（g∶mL）时不再有明显提高。这可能是因为溶剂用量增加后，溶剂中的AFT B1浓度降低，从而使得AFT B1与溶剂接触面的浓度增大，提高了传质推动力，加快了AFT B1的溶出速率[27]，在超声的协同作用下，AFT B1快速的释放、扩散及溶解[28]。因此，料液比选择1∶4（g∶mL）。

2.4 净化方法的选择

净化方法对提取率的影响见图4，色谱对照图见图5。

1.3 临床实践 选择 9例拟行机器人辅助腹腔镜前列腺癌根治术的患者。所有患者均经超声引导下经直肠前列腺穿刺活组织检查病理确诊，并进一步行盆腔磁共振成像及全身骨扫描检查排除局部侵犯和远处转移，同时评估患者前列腺和骨盆形态，符合机器人辅助腹腔镜前列腺癌根治术指征。3 名受训医师分别对 3例患者进行膀胱尿道吻合（图1D），记录吻合时间，并与腹腔镜前列腺癌根治术吻合时间对比。术后随访患者，检测引流液肌酐水平、评估漏尿情况。术后第 7 天行膀胱造影检查，注射造影剂 80 mL，评估吻合口愈合情况。

图4 净化方法对提取率的影响

图5 色谱对照图

（1）超声时间。将样品中AFT B1的含量加标至5 μg/kg。将处理后样品平均分成6 份，每份2.5 g，置于20 mL离心管中，以料液比1∶4（g∶mL）加入乙腈溶液，分别在40 ℃下超声提取15，20，25，30，35，40 min，超声后取5 mL 提取液完成衍生步骤，上机检测。

（128）尾尖光萼苔 Porella handelii S.Hatt.熊源新等（2006）；杨志平（2006）；余夏君等（2018）

2.5 单因素试验

2.5.1 超声时间

超声时间对检出率的影响见图6。

图6 超声时间对检出率的影响

由图6 可知，随着超声时间的延长，AFT B1的检出率逐渐增加，当超声时间达到30 min 时，检出率达到峰值78.4%，之后随着超声时间的增加，检出率不再有显著的变化。因此，选择超声时间30 min为最佳提取时间。

2.5.2 超声温度超声温度对检出率的影响见图7。

图7 超声温度对检出率的影响

由图7 可知，超声温度为30～40 ℃时，AFT B1的检出率随温度的增加而升高，当超声温度达到40 ℃时，检出率不再有显著的变化。因此，选择超声温度40 ℃为最佳超声温度。

2.5.3 乙腈质量分数

首先，旅游危机事件当事人和利益攸关方是网络舆情的主要发布者和传播者。该主体发布的信息从根源上决定了旅游危机事件网络舆情的传播内容和信息，其发布的关于旅游危机事件的网络舆情信息比其他任何传播主体发布的信息都更有说服力和煽动性，因而更能决定网络舆情传播的走向。相关管理部门要迅速、合理地解决旅游危机事件，尽量减小对旅游危机事件当事人和利益攸关方带来的负面影响，从而达到控制舆情扩散的目的。

乙腈质量分数对提取率的影响见图8。

图8 乙腈质量分数对提取率的影响

由图8 可知，随着乙腈质量分数的增加，AFT B1的检出率逐渐提高，当乙腈质量分数达到80%时，检出率达到83%，当乙腈质量分数超过85%时，检出率逐渐下降。因此，选择80%乙腈溶液为最佳溶剂质量分数。

2.6 正交试验结果

根据单因素试验的结果，选取超声时间、超声温度、乙腈质量分数3 个因素，以AFT B1检出率为指标进行L9（34）正交试验

第二，一般情况下，如话语(7)，话语表达的是标准化的隐意(7b);但在特定的语境中，同一话语会产生其他具有交际功能的隐意(7a)。此外，听话者依据同一个隐意还可推导出(7c1)或(7c2)等不同的交际意图。

正交试验设计与结果见表3，影响槟榔中AFT B1提取率各因子分析见表4。

表3 正交试验设计与结果

表4 影响槟榔中AFT B1 提取率各因子分析

由表3 可知，对槟榔中AFT B1的提取率影响的因素的排序为超声时间＞超声温度＞乙腈质量分数。由表4 可知，超声温度、超声时间影响显著。由表3可知，A2B2C1为最优组合即超声时间30 min，超声温度40 ℃，乙腈质量分数80%。

2.7 方法学考查

2.7.1 线性及标准曲线

正己烷体积对提取率及精密度的影响（n=6）见表2，正己烷体积对检出率的影响（n=6）见图1。

比较了70%，75%，80%，85%，90%，95%乙腈对检出率的影响。

配制质量浓度1～60 ng/mL 的标准系列工作液上机检测，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到AFT B1的线性方程及相关系数R2。由图9 可知，方程线性良好R2=0.999 8，b（截距）＜2% a（斜率），满足定量检测的要求。

2.7.2 精密度、回收率

在未发霉的槟榔干果样品中进行3 水平（0.5，5.0，20.0 μg/kg）6 平行加标。

加标回收率结果（n=6）见表5。

根据GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》被测组分含量小于0.1 mg/kg 时，回收率应为60%～120%，变异系数应小于15%。回收率为65.0%～87.5%，变异系数小于6%，说明回收率与精密度满足规范。

2.7.3 定量限与检出限

在2.5 g 空白样品中加入等量0.20 ng AFT B1的标准溶液，以基线的10 倍噪声值为定量限，3 倍为检出限，代入标准曲线计算[29]，定量限为0.06 μg/kg，检出限为0.02 μg/kg。

对《新视野》教材的研究主要是由于，在当下先行的国内通用学术英语教材中，《新视野》在各大高校应用广泛，是一套代表性较高的教材，使该研究的局限主要在于该文只对一套教材进行了量化处理；一套教材的语料库相对较小，因此对于其他学者来说，将来可以对其他教材进行分析或建立更大的语料库，为研究提供更具说服力的量化分析。且该教材在经扫描PDF格式转化为Word文本时出现较多错误之处，虽经过多次核对和问题纠错等步骤，由于人工校对精力有限，不可避免仍存在一些瑕疵。因此，如后续学者进行量化计算时，可相对着重处理该阶段性问题，减少失误。

2.7.4 霉变槟榔原果含量测定与成品测定

对20 批次槟榔原果、20 批次市售食用槟榔进行了AFT B1含量检测。

他曾希望远离尘嚣，机会来了，怎么反倒不安起来了呢？他打定主意随遇而安，开始打量起这间石屋。石壁上嵌着几盏油灯，永远那么燃着，既不变亮，也不变暗，也不摇动，仿佛是虚假的。

霉变槟榔原果检测结果见表6，食用槟榔检测结果见表7。

表6 霉变槟榔原果检测结果/μg·kg-1

表7 食用槟榔检测结果/μg·kg-1

由表6 可知，在霉变槟榔原果中，AFTB1测出的概率为15%，最低值为1.11 μg/kg，最高值为11.4 μg/kg，测出的概率不高。这是因为槟榔发生霉变不一定会产生黄曲霉，且有的黄曲霉不产黄曲霉毒素[30]。由表7 可知，市售食用槟榔的黄曲霉毒素B1的提取率为5%，均未超过DB 43/132—2004《食用槟榔》规定的5 μg/kg。

3 结论

基于GB 5009.22—2016 以槟榔为样品对高效液相色谱-柱前衍生法的前处理进行了优化，并选取对检出率有显著影响的提取条件进行了正交优化，最终得到优化前处理：衍生中正己烷体积2 000 μL，料液比1∶4（g∶mL），用乙腈为提取溶剂，不采用净化。优化提取参数为超声时间30 min，超声温度40 ℃，乙腈质量分数80%。该方法的加标回收率为66.2%～87.9%，RSD 值为2.53%～5.93%，定量限为0.06 μg/kg，检出限为0.02 μg/kg，符合GB/T 27404—2008 中对于痕量物质检测的要求。该方法操作简单、准确度高、精密度好、检测成本低，适用于检测槟榔中AFT B1的残留量。以该方法检测了霉变原果及市售食用槟榔的AFT B1含量，以及霉变原果槟榔与市售成品槟榔。检测结果显示，霉变原果测出的概率为15%，市售食用槟榔测出的概率为5%，均未超过DB 43/132—2004 的限量（5 μg/kg），但仍然应关注各流程中可能的污染来源及被污染区域，降低食用槟榔的安全风险，促进槟榔行业健康发展。