鸭肠炎沙门氏菌致病性差异研究*

魏可欣，石锐琪，林仲寅，李世恒，李继桐，李琦，吕俊峰

（山东省农业科学院家禽研究所，山东 济南 250100）

沙门氏菌属肠杆菌科，是一种革兰氏阴性肠道杆菌，一般无荚膜，大多数有周身鞭毛。家禽是肠炎沙门氏菌的天然感染对象，雏鸭感染尤为严重。感染雏鸭精神沉郁，食欲不振，排白色如水状的粪便，肛门周围绒毛被粪便污染[1]，死亡率升高。剖检可见心脏肿大，并伴有出血现象，严重时会有干酪样物。肝脏肿大，出现点状出血或者局部坏死，卵巢和卵泡也会出现一定程度上的坏死[2]。沙门氏菌病已成为危害山东省肉鸭养殖的主要细菌性疾病之一[3]，因此需对该病的病原菌分离鉴定，测定、分析不同沙门氏菌致病性差异，为临床防控与治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

分别于山东不同地区肉鸭养殖场内采集新鲜粪便样本及泄殖腔拭子，具体采集数量见表1。

表1 样品采集信息

1.2 试剂与引物

实验所用TSA 固体培养基、LB 固体、液体培养基均由本实验室配制保存；2×Tap PCR StarMix试剂盒购自康润诚业生物科技（北京）公司。

根据胡兴娟等人的报道[4]，按照肠炎沙门氏菌sdf 基因设计特异性引物，引物序列和扩增片段如表2 所示。

表2 引物序列

2 方法

2.1 细菌分离培养

吸取50 μL 采集的样品液均匀涂抹至TSA 固体培养基上，每个培养基各接种4 类样品，37 ℃培养12 h 观察TSA 培养基是否有菌落生长。挑取生长的单菌落使用四区划线法接种至LB 固体培养基中37 ℃培养12 h[5]，以同种方法连续纯化3次，挑取3 次纯化后的单菌落加入LB 液体培养基，过夜培养后置4 ℃保存。

2.2 PCR 鉴定

以2.1 保存的菌液为模板，以sdf-F/R 为引物进行PCR 扩增。PCR 反应体系为2×Tap PCR StarMix 10 μL，sdf-F/R 各1 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共30 个循环，72 ℃终延伸10 min。将获得的PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2.3 动物回归试验

取2.1 待检沙门氏菌以1:100 比例转接至20 mL LB 液体培养基，120 r/min 摇菌培养5~6 h，经细菌平板计数可知细菌数为1.15×1012CFU/mL。将菌液11 000 r/min 离心15 min，用无菌 PBS 溶液重悬沉淀菌体并继续离心，重复3 次后用适量无菌PBS 溶液重悬制成菌液浓度为1.15×109CFU/mL的悬菌液，分为5 组并标记备用[6]。

取50 只7 日龄的雏鸭随机分为1 组对照组和5 组试验组，对照组10 只，试验组40 只，5 组试验组分别命名为沙门1、2、3、4、5 组，每组8只，各组单独饲养。将配制的5 组菌液分别接种各试验组，每只雏鸭腿部肌肉注射0.2 mL 浓度为1.15×109CFU/mL 的悬菌液，对照组每只腿部肌肉注射0.2 mL 生理盐水。

攻毒后的第1、3、5 天每组分别称重并剖检两只雏鸭，第7 天将全部雏鸭称重后颈部放血处死。取剖检雏鸭心脏、肝脏、肺脏、十二指肠、脾脏等主要脏器称取重量，观察是否出现病变。使用烧红的烙铁将剖检肝脏表面消毒，无菌接种环穿透肝脏表面接种至LB 固体培养基中，按2.2方法进行鉴定，检测剖检鸭肝脏中是否含有沙门氏菌。

3 结果

3.1 分离培养结果

细菌分离培养结果显示，在获得50 份样品中共有5 份样品（J1356、J1329、J1360、J1362、J1363）出现菌落生长。眼观菌落边缘整齐、光滑圆润（图1），与沙门氏菌菌落形态相似，故初步判定为沙门氏菌[7]。5 份样品分别命名为沙门氏菌1、2、3、4、5 组。

3.2 PCR 鉴定结果

PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，除空白对照外，试验组沙门氏菌1~5 组均于119 bp 处出现特异性条带（图2）。将PCR 产物测序结果进行Blast 比对确认检测的5 株菌均为肠炎沙门氏菌。

图2 琼脂糖凝胶电泳结果图

3.3 动物回归试验结果

致病性试验结果显示，沙门氏菌5 组毒力最强，其次依次为沙门氏菌2 组、4 组、3 组、1组，死亡率分别为87.5%、75%、62.5%、50%、12.5%，对照组无死亡（图3）。

图3 试验组各组存活率（详见附录彩图）

观察攻毒组雏鸭形态体征，发现接种沙门氏菌3 组与5 组悬菌液的雏鸭体态受影响最大。感染鸭跛行严重，不能正常行走；沙门氏菌3 组对雏鸭的体态运动有较大的影响，同样出现跛行，但症状较2、5 组轻，发生运动障碍；4 组前期对体态无影响，没有症状出现，随日龄增长，逐步危害体态，使其运动发生障碍；1 组对雏鸭的体态几乎没有影响。对照组雏鸭精神状态良好，体态正常，饮食未有异常。

雏鸭剖检观察结果显示，试验组心脏、肺脏、十二指肠重量均轻于同日龄对照组雏鸭，脾脏则普遍重于同日龄对照组；沙门氏菌2 组、5 组心脏病理变化不明显，肝脏有不同程度肿胀、出现大小不一的出血点和坏死灶。接毒72 h 后，沙门氏菌1 组心脏出现心包炎及出血，心脏外膜有黄白色纤维素样物质渗出，出现坏死灶或结节；肝脏发生肝周炎，肝脏表面渗出白色纤维素状物，出现坏死灶；肝被膜与胸壁、心脏腹膜发生粘连。脾脏、肺脏、十二指肠也有轻微病变：脾脏不同程度肿胀、出血、淤血；肺脏不同程度出血，呼吸道出现大量的黏液；十二指肠仅见少量出血点，未出现明显病变。同日龄对照组雏鸭各组织脏器均正常，无任何病变和坏死灶。由此可见，分离到的5 株沙门氏菌菌株对心脏、肝脏的致病性有较大差异，对其余脏器也有致病性，但各组间差异较小。

对各组感染鸭肝脏进行细菌分离鉴定，沙门氏菌2、3、4、5 组在LB 固体培养基上生长出灰白色、半透明状的菌落，对分离得到的18 个带菌平板挑取单菌落进行PCR 反应并经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图4 所示。除空白对照外，挑取的18 个单菌落均于119 bp 处出现特异性条带。将PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果上传NCBI 经Blast 比对后确定为肠炎沙门氏菌。

图4 分离细菌的凝胶电泳结果图

4 结论

本试验自山东省部分地区肉鸭养殖场采集的病料中分离到5 株沙门氏菌，经过一系列检测鉴定确认为鸭肠炎沙门氏菌，分别命名为沙门氏菌1、2、3、4、5 株。动物回归试验结果表明，分离到的5 株沙门氏菌均有不同程度的致病性，且不同的菌株致病力不同，多呈现急性或者亚急性感染。从致病性来看，5 组的致病性最强，死亡率高达87.5%，其次为2 组、4 组、3 组、1 组；从病理变化来看，2 组、5 组的病理变化不明显，仅出现肝脾肿大、出血等现象，4 组感染鸭出现卵黄吸收障碍，1 组和3 组病变不明显，致死率也较低，更倾向发展为隐性感染。因此，感染沙门氏菌的雏鸭除出现病变严重、死亡等显性症状外，也极容易出现隐性感染，这种感染会使鸭产品成为肠炎沙门氏菌的隐性传染源，威胁养殖业发展，危害人类健康。若想预防沙门氏菌的感染，应从传染源、传播途径入手，注意加强鸭舍内外环境、饮食环境的消杀，阻断或降低环境因素导致的水平传播风险[8]。