C 型副鸡禽杆菌山东株的分离及PCR 鉴定*

吴忆春，苗立中

（1.滨州职业学院生物工程学院，山东 滨州 256603；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum, Apg）是鸡传染性鼻炎的病原菌，可引起鸡上呼吸道感染，导致蛋鸡产蛋率下降和育成鸡死淘率增加，造成严重的经济损失[1]。Page 采用玻片凝集法将副鸡禽杆菌分为A、B、C 三种血清型[2]。Blackall 等采用血凝抑制方法（HI）把A 型和C型分为4 个亚型（A1~A4，C1~C4）[3]。该病在全世界广泛流行。我国首例鸡传染性鼻炎报道于1987 年，分离于北京某养殖场，鉴定为A 型副鸡禽杆菌[4]；林毅等在1995 年分离到C 型副鸡禽杆菌[5]；2002 年以后陆续有分离到B 型副鸡禽杆菌的报道[6-7]。

2022 年11 月份山东某蛋鸡养殖场饲养的蛋鸡接连出现疑似感染传染性鼻炎的症状，如颜面肿胀、鼻腔和鼻窦有浆液性分泌物等。经问诊了解，该批次蛋鸡发病前1 个月刚接种鸡传染性鼻炎A 型灭活疫苗。为了查找免疫失败原因，通过对病鸡剖检、细菌分离、PCR 鉴定、血清分型，对分离菌株进行了初步鉴定。此外，选择了编码免疫保护相关血凝蛋白基因的HMTp210 基因高变异Region 2 进行了测序分析，确诊该蛋鸡场鸡群发病为C 型副鸡禽杆菌感染引起。

1 材料与方法

1.1 试验材料

副鸡禽杆菌培养基购买自北京海天生物科技有限公司，鸡血清购买自天津康源生物，辅酶购买自上海源叶生物，引物合成自上海生工，副鸡禽杆菌A、B、C 阳性血清和副鸡禽杆菌A、B、C 标准菌株购自中国兽医药品监察所。基因组提取试剂盒购自北京百泰克生物科技有限公司。Genstar 2×Taq mix 购自康润生物。

1.2 细菌分离

无菌剪开发病鸡的眶下窦，用接种环蘸取眶下窦内容物，在含有NAD 的血清琼脂平板上划线，于蜡烛罐中厌氧培养24~48 h。挑取单个可疑菌落接种到含有NAD 的血清琼脂平板上，进行纯培养。挑取平板上的单菌落，革兰氏染色镜检，观察细菌形态。

1.3 PCR 鉴定

取纯化的菌株液体培养物，采用细菌基因组提取试剂盒提取基因组，作为PCR 模板。参照《中华人民共和国农业行业标准：鸡传染性鼻炎诊断技术》（NY/T538-2015 ）设计、合成引物，引物序列如下：

反应体系：2×Taq mix 12.5 μL，A-F（10 μmol/L）1 μL，A-R（10 μmol/L）1 μL，模板1 μL，无菌去离子水10.5 μL，总体积为25 μL。反应程序：94 ℃预热5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30 个循环，72 ℃ 10 min。

反应结束后，1%琼脂糖凝胶检测，在凝胶成像系统观察是否有500 bp 大小的目的条带出现。

1.4 动物回归试验

用60 日龄SPF 鸡6 只，置于负压隔离器中饲养，其中4 只在眶下窦内注射分离菌株液体培养物，0.2 mL/只，含菌量为1.5×105CFU/0.2 mL，剪翅作为标记；其余2 只鸡在眶下窦注射液体培养基作空白对照，置另一隔离器饲养。观察14 日，记录发病情况，并再次取鼻窦分泌物进行细菌分离培养。

1.5 血清型鉴定

具体方法参照NY/T538-2015 的血凝抑制试验（鉴定副鸡禽杆菌血清型）部分。如被检抗原与某型阳性血清的HI 效价最高，则判定该抗原为该血清型。

1.6 HMTp210 基因Region 2 序列测序

采用Ryuichi 等[8]设计的一对扩增HMTp210基因高变异2 区的引物，引物序列如下：

反应体系：2× ExTaq mix 25 μL, H-F（10 μmol/L）1 μL，H-R（10 μmol/L）1 μL，模板1 μL，无菌去离子水22 μL，总体积为50 μL。反应程序为：98 ℃ 预热1 min，98 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30 个循环，72 ℃ 10 min。

反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，回收产物送上海生工测序。Blast 搜索GenBank 中的同源序列，采用分析软件MegAlign中的Clustal W 方法进行序列比较分析并构建系统发育树。

2 结果

2.1 细菌分离

在含有NAD 的血清琼脂平板上，生长出无色细小菌落，菌落湿润、光滑、边缘整齐。革兰氏染色观察呈阴性小杆菌，细菌均匀分散排列；分离菌株命名为SD-2022。

2.2 PCR 结果

PCR 产物电泳结果显示，分离的菌株与阳性对照均在500 bp 左右有特异性目的条带（图1），与预期大小一致，推测分离到的菌株为副鸡禽杆菌。

图1 副鸡嗜血杆菌PCR鉴定结果（详见附录彩图）

2.3 动物回归试验结果

经眶下窦注射分离菌株SD-2022 菌液的4 只SPF 鸡在24~72 h 内均出现眶下窦及面部水肿、食欲减退、呼吸困难等典型的鸡传染性鼻炎临床症状；对照组未有明显的临床症状。取发病鸡鼻窦分泌物进行细菌的分离培养，经培养形态观察、革兰氏染色镜检结果、PCR 检测结果综合判断该分离菌为副鸡禽杆菌。

2.4 血清型鉴定结果

血清型鉴定结果如表1 所示。根据血凝抑制试验，分离株SD-2022 抗原与C 型阳性血清具有最高的血凝抑制效价，可判定分离株的血清型为C 型。值得注意的是，分离菌株SD-2022 的抗原与A 型血清也具有血凝效价，说明分离菌株SD-2022 抗原与A 型菌株血清具有交叉反应。

表1 分离株SD-2022 的抗原鉴定结果

2.5 HMTp210 基因Region 2 测序结果分析

副鸡禽杆菌HMTp210 基因Region 2 测序结果显示，扩增SD-2022 菌株的HMTp210 基因Region 2 序列长为1 689 bp。所得序列在GenBank中BLAST CBI 数据库与已发表的副鸡禽杆菌HMTp210 基因2 区序列进行同源性比较，在所得的83 个检索结果中，选取已知血清型的副鸡禽杆菌菌株，从GenBank 上下载其HMTp210 基因2区序列，用MegAlign软件中的Clustal W方法分析，构建系统发育树（图2）和同源率图谱（图3）。结果可知，分离菌株SD-2022 与CP113955.1-CChina C 型副鸡禽杆菌HMTp210 基因Region 2 序列同源性最高，为99.8%；与TW07、TW94C 型分离株H18 株同源性较低，为87%左右。分离菌株SD-2022 与国内A 型和B 型副鸡禽杆菌分离株HMTp210 基因Region 2 序列同源率为90.4%。

图3 SD-2022菌株与Genbank中其他27种副鸡禽杆菌的同源率图谱

3 讨论

近几年来，随着国家对饲料禁抗、蛋鸡产蛋期禁抗政策实施以来，鸡传染性鼻炎的发生和流行呈上升趋势，养殖场虽然加强了鸡传染性鼻炎疫苗的免疫预防，但国内很多蛋鸡场仍发生鸡传染性鼻炎免疫失败的事件，给养殖户造成了较大的经济损失[9]。

HMTp210 基因是编码副鸡禽杆菌外膜蛋白的一段基因序列，被认为是A 型和C 型Apg 主要的保护性抗原基因和致病性基因[10]。其中Region 1和Region3 基因序列在Apg 血清A 型和C 型之间高度保守，高变区Region 2 的基因序列在Apg 血清A 型和C 型之间差异较大，具有一定的血清型特异性[11]。为了分析该蛋鸡养殖场致病菌株与常见流行株保护性抗原差异，本文对HMTp210 基因Region 2 序列进行了扩增测序、Blast 比对。结果分析显示，分离株SD-2022 与CP113955.1-C-China C 型流行株主要保护性抗原同源率高达99.8%，与TW07、TW94 等C 型流行株同源性为87%左右，与国内A 型、B 型流行株的同源率也较低。有文献报道，副鸡禽杆菌4 种A 型血清型（A1~A4）之间具有很好的交叉免疫保护，但4种C 型血清亚型（C1~C4）之间免疫交叉保护效果有限，同时A 型、B 型和C 型不同血清型之间交叉免疫保护效果不尽人意[12]。限于条件限制，本次试验未能对SD-2022 分离株进一步进行C 型（C1-C4）亚型分型。调查发现该蛋鸡场只免疫了鸡传染性鼻炎A 型灭活疫苗，不能对C 型副鸡禽杆菌产生很好保护，这可能是该蛋鸡场免疫失败的主要原因。

鸡传染性鼻炎发生的原因是鸡群未免疫或疫苗所含菌株与流行菌株血清型不对型造成的。因此，加强流行病学调查，筛选免疫原性好的疫苗菌株，研制含A 型、B 型、C 型的多价灭活疫苗或基因工程疫苗[13-14]是减少鸡传染性鼻炎发病的有效方法。下一步，将对SD-2022 菌株的毒力和免疫保护性试验开展工作。