超声辅助法提取当归总黄酮工艺优化研究*

汪 凡，张 旭，汪本宗，彭文彬，郑秀文，周雪韦，赵启宇，宋俊梅

(巢湖学院，安徽 合肥 238024)

当归为伞形科植物当归(Angelicasinensis(Oliv.)Diels)的干燥根。秋末收获，除去泥沙和须根，只保留主根；待水分稍微蒸发，包扎成小捆，上棚，用烟火慢慢烘干，再切薄片[1]。当归又名秦归、马尾归、马尾当归等，最早记载于《神农本草经》中，主要产自于我国云南、甘肃等地。其味甘、辛而温，中医认为归心、肝、脾经，具有补血调经、活血止痛、润肠通便的功效[2-3]。所谓“十方九归”，可见当归在中医组方中的重要地位，故有“药王”之称。研究发现当归还具有抗氧化、抗肿瘤、消炎、平喘、抗抑郁等功能，在妇科疾病中也有广泛的应用[4]。

黄酮是当归的重要成分之一。黄酮类化合物是一类多酚类天然产物，常以游离态或与糖结合成苷的形式存在于几乎所有绿色植物中。黄酮类化合物具有广泛的药理活性，分布广泛，种类繁多，且多数化合物容易以结晶形式获得[5-8]。当归总黄酮经分离纯化后可分为木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷和木犀草素-7-O-芦丁糖苷两类[9]。当归作为一种良好的中药抑菌剂，其总黄酮对于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等菌具有一定的抑制作用；还能够调节心脑血管系统，促进胰岛B细胞的恢复，降低血糖和胆固醇。因此对糖尿病及其并发症具有一定治疗作用，也降低辐射对DNA的损伤[10]。

目前总黄酮的提取方法主要有超声提取法、加热回流法、超声复合酶法等，超声辅助浸取便是利用超声波产生的机械效应、空化效应、热效应等增加溶剂的穿透力，可使物料中的有效成分加速溶出，大大减少提取时间，提高提取效率[11]。因此，本实验以干燥当归切片为原料，采用超声提取法探讨当归总黄酮提取工艺，通过单因素及正交实验考查乙醇浓度、超声时间、超声功率、物料比对当归总黄酮含量的影响，以期为提高当归总黄酮类化合物的提取效率提供参考依据。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

当归，产地为甘肃定西；医用酒精(C2H5OH)，95%，河北瑞康医药科技有限公司；亚硝酸钠(NaNO2)，分析纯，天津市天茂化学试剂厂；氢氧化钠(NaOH)，分析纯，西陇化工股份有限公司；硝酸铝[Al(NO3)3·9H2O]，分析纯，天津市天茂化学试剂厂。

电子天平(FA1004N)，上海箐海仪器有限公司；新型密封型摇摆式高速粉碎机(100克)，雷迈机械设备有限公司；数控超声清洗仪(500W)(JK-500DB)，合肥金尼克机械制造有限公司；循环水式多用真空泵(SHB-ΙΙΙ)，河南省予华仪器有限公司；旋转蒸发仪(41K30RA-C)，巩义市予华仪器有限责任公司；紫外可见分光光度计(UV-5100B)，上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的制备

用芦丁标准品配置成 0.4 mg/mL 的芦丁标准品溶液，用吸量管准确量取0.5、1.0、2.0、3.0、3.5、4.0 mL 置于试管中，后分别加入 1 mL 质量分数为5%的亚硝酸钠溶液，摇匀后静置 6 min；再吸取 1 mL 质量分数为10%的硝酸铝溶液，摇匀后静置 6 min；最后加入 10 mL 质量分数为4%的氢氧化钠溶液；再加入60%的乙醇溶液稀释至 25 mL，摇匀静置 10 min；在 510 nm 的条件下分别测定其吸光度。以芦丁标准品的质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。得到芦丁标准回归曲线方程Y=0.5224X-0.0813 (r=0.9995)。

图1 芦丁标准曲线

1.2.2 当归总黄酮提取及含量测定

称取 4 g 当归，进行超声提取，过滤，取滤液，旋转蒸发得到蒸发液。用乙醇溶液定容至50 mL得到总黄酮提取液。采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法，在 510 nm 条件下测定其吸光度，平行3次。利用(1)式计算当归总黄酮的提取率：

(1)

式中：m1为试样的测定质量，mg；D为稀释倍数；m0为称量的当归质量，g。

1.2.3 单因素实验

1)乙醇体积分数的选择

选择乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%，超声时间 30 min，超声功率40%，物料比 1∶10 g/mL。

2)超声时间的选择

选择乙醇体积分数60%，超声时间 30 min，超声功率40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，物料比1∶10。

3)超声功率的选择

选择乙醇体积分数60%，超声时间 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，超声功率80%，物料比 1∶10 g/mL。

4)物料比的选择

选择乙醇体积分数60%，超声时间 20 min，超声功率80%，物料比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL。

1.2.4 正交实验优化提取工艺

综合上述单因素实验结果，进而设计正交表，进行实验，采用正交实验法在四因素三水平上对当归总黄酮的提取工艺进行优化。

1.2.5 验证实验

对正交实验筛选的最佳提取工艺组合进行验证，按最佳组合条件进行实验，并与先前各组实验数据进行对比，以验证最佳提取工艺的可靠性。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇质量分数

由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，当归总黄酮的提取量呈现先上升后下降的趋势。在乙醇体积分数处于30%～60%时，当归总黄酮提取量呈上升趋势，在乙醇体积分数为60%时，提取量达到最大值；随着乙醇体积分数的进一步增大，可能是乙醇体积分数过高时，增大了脂溶性物质浸出增加，杂质增加，从而当归总黄酮的提取量减少[12]。因此选择乙醇体积分数50%、60%、70%进行正交实验。

图2 乙醇浓度对当归总黄酮的影响

2.1.2 超声功率

由图3可知，随着超声功率的增加，当归总黄酮的提取量先增加后减少。在40%～80%范围内，当归总黄酮提取量随超声功率增加而增加；超声波的空化效应、机械效应、热效应使细胞破裂程度增加，当归总黄酮的浸出率增大。而超过80%时，对细胞的破坏达到最大，使大量杂质开始溶出，且对黄酮类化合物产生一定破坏，从而使当归总黄酮提取量下降[13]。因此选择超声功率70%、80%、90%进行正交实验。

图3 超声功率对当归总黄酮的影响

2.1.3 超声时间

由图4可知，在10～20 min 范围内，超声波对细胞有一定破坏作用。随着时间的增加，细胞破裂更充分，有利于黄酮类化合物的浸出。而超过 20 min 以后，杂质的浸出量增加，过长的超声时间，也对当归总黄酮产生一定破坏，使得总黄酮的提取量下降[14]。因此选择超声时间 10、20、30 min 进行正交实验。

图4 超声时间对当归总黄酮的影响

2.1.4 物料比

由图5可知。随着物料比的增大，当归总黄酮提取量基本呈先上升后下降再缓步上升的过程。当物料比在1∶5～1∶15 g/mL 范围内，随着浸取液增加，溶出的黄酮类化合物含量增加。超过 1∶15 g/mL 时，其他杂质的溶出量增加，改变浸取液理化性质，使当归总黄酮的浸出量减少[15]；故在物料比为 1∶15 g/mL 时当归总黄酮提取量最大。因此选择物料比1∶10、1∶15、1∶20 g/mL 进行正交实验。

图5 物料比对当归总黄酮的影响

2.2 正交实验

为优选当归总黄酮超声提取工艺，根据单因素考察结果和正交试验设计方法原则，按照L9(34)正交试验(表1)。

表1 正交实验因素水平表

正交试验设计及结果见表2。根据正交分析图中，从影响因素乙醇浓度来看，三个水平中均值一最高，表明乙醇体积分数为60%时提取率最大；从影响因素超声功率来看，三个水平中均值三最高，表明超声功率为90%时提取效率最大；从影响因素超声时间来看，三个水平中均值一最高，表明超声时间 10 min 时提取效率最大；从影响因素料液比来看，三个水平中均值三最高，表明料液比为 1∶20 g/mL 时提取效率最大，综上所述较优提取工艺为应选择A2B3C1D3的条件即超声功率90%、乙醇浓度60%、超声时间 10 min、料液比 1∶20 g/mL。由极差分析可知，超声功率对当归总黄酮的影响较大，各因素的主次顺序为B(超声功率)﹥A(乙醇体积分数)﹥C(超声时间)﹥D(料液比)。

表2 正交实验设计及结果

2.3 验证实验

为了验证正交实验结果的可行性与稳定性，以正交实验所得超声功率90%、乙醇浓度60%、超声时间 10 min、物料比 1∶20 g/mL 进行验证实验，三次平行实验如表3，得到当归中提取总黄酮的含量均值为4.9018(mg/g)。并与正交实验结果对比分析，因此确认该设计方法得到的当归总黄酮的提取条件合理有效。

表3 验证实验结果与极差分析

3 结论

采用超声辅助提取当归总黄酮，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法检验总黄酮的提取量，利用单因素实验和正交实验对提取工艺进行优化。在对乙醇浓度、超声功率、超声时间、物料比4个单因素实验的基础上，通过正交实验优化得到影响当归总黄酮提取量大小的因素为：超声功率﹥乙醇浓度﹥超声时间﹥料液比，最佳的提取方案为A2B3C1D3，即超声功率90%(450 W)、乙醇体积分数60%、超声时间 10 min、料液比 1∶20 g/mL，并通过验证实验得到在此条件下当归总黄酮的提取量为4.9018(mg/g)。

在大健康产业背景下，国家越来越重视药食两用产业的发展，2019年新增当归为药食两用物质。本实验采用超声提取法，优化当归总黄酮提取工艺，旨为进一步开发和利用当归总黄酮提供理论依据；同时，有利于促进中国传统中药现代化。