毫火针对膝骨关节炎模型大鼠软骨稳态的调节作用

田玲玲, 罗志辉,顾晓磊,闫 鹏△

(1.荆州市第二人民医院,湖北 荆州 434000;2.湖北中医药大学,湖北 武汉 430065)

关节软骨指覆盖于长骨表面的一层薄薄的透明软骨[1]。由软骨细胞、蛋白聚糖、葡糖氨基葡聚糖、胶原和70%～80%的水组成[2-3]。在运动过程中,负重关节特别是膝关节软骨会承受自身体重数倍的负荷,长期的反复运动或者瞬时的暴力冲击均会导致关节损伤[4]。损害后的修复以纤维性愈合为主,这种软骨不具备透明软骨的机械性能,容易崩解退变,最终进展为骨性关节炎并导致关节疼痛和功能障碍[5-7]。所以,让关节软骨维持在透明软骨的稳定状态是治疗骨关节炎的最终目的。

从临床观察来看,毫火针对膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)疗效确切,不仅能够缓解患者的疼痛程度,还可以改善患者的生活质量[8-9]。但毫火针治疗KOA的具体机制尚不十分清楚。基于此,本研究首先建立KOA模型大鼠,然后分组进行干预。着重从以下4个方面进行评估,一是观察毫火针对KOA运动功能的改善情况;二是观察毫火针对关节内炎性微环境的调节作用;三是观察毫火针对KOA分子机制的改变及通路的调节情况;四是观察毫火针对关节软骨病理改变的修复程度。

由此我们可以清楚地看到，王钻清在诗歌写作中，并非像某些诗歌写作者那样，仅仅是满足于卡拉OK似的自娱自乐，而是有着更加开阔的诗歌艺术境界和宏伟的写作抱负。王钻清是一个博览群书，对于中国传统文化有着深厚学养的学者型和性情诗人。在诗歌写作中，他不屑于表现那种个人的小情趣和井蛙之见，而常常将目光转到整个的人类和古老的历史，正是因为有了这样密切关乎人类命运和心灵的哲学思考，我们在阅读王钻清的诗歌时，才能够深深地感受到那种与众不同，直击人心，撼人心魄的艺术力量。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

48只清洁级SD大鼠,雌雄各半,体质量155～170 g,购自湖北省实验动物研究中心[许可证号:SCXK(鄂)-2020-0018]。所有动物饲养于湖北中医药大学针灸骨伤学院中心实验室,室内空气流通,室温(25±2)℃,相对湿度为60%,并进行12 h昼夜循环光照条件。经适应性喂养1 周后按随机数字表法分为空白对照组、模型组、毫火针组和普通毫针组,每组12只。整个实验全程遵守《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 木瓜蛋白酶(货号:P4762,sigma公司);0.30 mm×25 mm华佗牌毫针(苏州医疗用品有限公司);聚合酶链反应(qRT-PCR)相关试剂:SYBR(DBI公司,德国);ELISA试剂盒(北京欧北生物科技有限公司);6×上样缓冲液、TRIZOL、逆转录试剂盒和核酸(TAKALA公司);单克隆抗体COL-Ⅱ和IL-1β(武汉博士德生物技术有限公司)。

与空白组比较,模型组的COL-Ⅱ和SOX9显著下降(P<0.01),IL-1β和TNF-α显著升高(P<0.05)。与模型组比较,毫火针组的COL-Ⅱ和SOX9明显升高(P<0.05或P<0.01),IL-1β和TNF-α明显降低(P<0.05);毫针组的COL-Ⅱ显著升高(P<0.05),其余没有明显变化。与毫火针组比较,毫针组的COL-Ⅱ和SOX9明显下降,但差异比较无统计学意义(P>0.05);IL-1β和TNF-α显著升高(P<0.05或P<0.01)。见表4和图1。

1.3 造模方法

“老婆，咱们终于发达了！”他一边说，还一边打着嗝，隔老远都能闻到酒味，不一会儿酒味就充斥了整个屋子。看到他满脸潮红，我心里有说不出的滋味。

首先制备4%的木瓜蛋白酶溶液,除正常组外大鼠按照0.25 mL/kg进行右膝关节腔注射。注射时间为第1、3与7天。正常组膝关节腔注射等量生理盐水[10]。在此期间密切观察大鼠饮食、精神、大小便和右后肢末梢循环。

1.4 干预方式

空白组不做任何处理,仅同时抓取捆绑。其余3组抓取捆绑固定后,用酒精灯外焰将毫针烧至红白,快速点刺患肢的“内膝眼”“犊鼻”“足三里”,每穴3～5下,点刺深度为1～2 mm,每周3次。参照《实验针灸学》[11]和大鼠穴位图谱进行取穴,每周3次,1个月后观察疗效。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 行为学观察 于造模成功后和每周干预结束后对大鼠进行步态和爪压的行为学进行评估。将大鼠放入3 m×3 m的无障碍场地中,自由活动5 min后观察大鼠步态;将大鼠置于大小为25 cm×25 cm×20 cm的透明玻璃室中,在玻璃室下面有一面呈45°放置的镜子,以便清晰地观察大鼠足部,使其自由活动5 min,评估大鼠右后爪压[12]。

公共图书馆的服务品牌是服务项目或服务机构加上之外的附加值。在公共图书馆的服务项目和服务活动中，体现出服务的优势、特色和强项并据以展示其服务的美誉度和影响力，是一个图书馆最具识别度的形象文化呈现。最优秀的服务品牌往往是一个图书馆、乃至一个城市甚至一个国家文化的名片。

1.5.2 分子生物学检测 行为学评估结束后,用1%戊巴比妥(0.6 mL/100 g)腹腔注射进行麻醉,将其仰卧固定于手术台上,右侧膝关节剃毛后常规消毒,然后用注射器抽取关节液进行ELISA检测。检测指标为白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。软骨组织于液氮中研磨,加入RIPA裂解液以及1 mol/L的PMSF进行超声匀浆裂解,然后以4 ℃、12 000 r/min离心15 min取上清液5 μL进行蛋白定量,将裂解后的蛋白样品按1∶4的比例加入5×的SDS蛋白上样缓冲液混匀,最后在100 ℃沸水中加热5 min使蛋白充分变性,储存于-20 ℃保存待测。蛋白样品经10%的分离胶和5%浓缩胶凝胶电泳后,根据Marker位置切取目的条带和内参条带,再将蛋白于预冷的转膜液里转至PVDF膜,PVDF膜经5%脱脂牛奶封闭1～2 h后,孵育一抗过夜,次日孵育二抗洗膜30 min后按1∶1比例配制ECL显影液滴加到膜上于ScnImage image analysis software凝胶成像系统中拍摄扫描图片,Image J软件分析条带灰度值,以GAPDH灰度值为内参。用Trizol裂解液收集各组软骨组织并提取总RNA,然后用Nano Drop蛋白核酸定量仪检测RNA浓度。用日本TOYOBO公司的反转录试剂盒把提取出来的RNA反转录为cDNA。构建荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)体系,20 μL包括10 μL SYBR Mixture,1μL的上游引物和下游引物,1μL的cDNA样本,然后加DEPC水至20 μL。设置反应条件,39个循环后检测溶解曲线,每组设3个复孔,以GAPDH 内参。各组 CT值按公式 2-ΔΔCT,然后计算相关指标的相对表达量。相关基因的引物序列见表1。

表1 目的基因和内参基因的引物序列

1.5.3 病理学检测 取材后将软骨标本置于4%多聚甲醛中固定,24 h后纯水冲洗,石蜡包埋。结束后用冰冻切片机切成2～3 μm的切片,然后进行免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色。根据染色切片观察软骨胶原纤维修复情况,评估其修复程度。

1.6 统计学方法

所有实验数据表示为均值±标准差。使用SPSS 23.0统计软件进行统计分析,使用GraphPad 6.0软件进行数据转化。以P<0.05为差异有统计学意义。

1.1.2 材料和仪器 CCR9、TLR4引物来源于北京鼎国生物技术有限公司。9700PCR仪来源于美国ABI公司。兔抗人CCR9、TLR4及羊抗兔二抗来源于美国SantCruz公司。

2 结果

2.1 各组步态及爪压评估

用ELISA法检测各组大鼠关节液中炎症相关指标白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。与空白组比较,模型组的IL-1β和TNF-α均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,毫火针组和毫针组的IL-1β和TNF-α均显著下降(P<0.05或P<0.01)。与毫火针组比较,毫针组的IL-1β和TNF-α均显著升高(P<0.01)。见表6。

表2 各组大鼠步态评估

表3 各组大鼠爪压评估

2.2 毫火针对软骨炎性微环境mRNA的影响

1.2.2 仪器 实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司,美国);电泳仪及转膜仪(Bio-Rad公司,美国);微量移液枪(Sanyo,日本);超净工作台VCM-620(再鑫仪器有限公司,中国);恒温摇床MR-570(优宁博仪器有限公司,中国);ELB700酶标仪( Bio-Tek 公司,美国);荧光倒置相差显微镜(LEICA公司,德国);低温高速离心机D3035(SCILOGEX公司,美国);斡旋振荡器和瞬时离心机YN-3524(优宁博仪器有限公司,中国)。

石英占矿物总量的56.1%，主要呈他形、半自形粒状以及粒状集合体分布(图1a、图1c)，粒度约为0.1～8 mm。黄铁矿、黄铜矿、闪锌矿和磁黄铁矿等硫化物矿物常分布于石英粒间以及多个石英颗粒组成的粒间孔洞中；黄铜矿、闪锌矿和方铅矿等硫化物矿物集合体常发育于石英裂隙和粒间孔洞中(图1a、图1b)，由于受到应力作用的影响，粒径较大的石英常具波状消光及应力裂纹。

图1 mRNA溶解曲线图

表4 毫火针对软骨炎性微环境mRNA的影响

2.3 毫火针对大鼠软骨表型蛋白的影响

问题一：写作范围大而无当，写作内容杂乱无章。有些学生在习作中描写美丽的校园，从小学部写到幼儿园，从大樟树到农场里的蔬菜，东拉西扯，杂乱无章，导致文章虽然篇幅很长，但却不能突出重点。

二型胶原(COL-Ⅱ)是软骨组织的特异性表达蛋白,是维持软骨稳态重要的参考依据。与空白组比较,模型组的COL-Ⅱ显著下降(P<0.05),IL-1β显著升高(P<0.01)。与模型组比较,毫火针组的COL-Ⅱ明显升高(P<0.01),IL-1β显著降低(P<0.01);毫针组的COL-Ⅱ显著升高(P<0.01),IL-1β显著降低(P<0.01)。与毫火针组比较,毫针组的COL-Ⅱ显著下降(P<0.05),IL-1β显著升高(P<0.05)。见图2、表5。

图2 毫火针对大鼠软骨表型蛋白的表达情况

表5 毫火针对OA大鼠软骨表型蛋白相对表达量

2.4 毫火针对大鼠炎性微环境的影响

经过4周的干预,与空白组比较,模型组的步态和爪压评分均升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,毫火针组与毫针组均显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)。与毫火针组比较,毫针组步态和爪压评分均显著更高(P<0.01)。见表2和表3。

表6 毫火针对大鼠炎性微环境的影响

2.5 免疫组织化学分析软骨损坏情况

COL-Ⅱ是软骨组织的标志性表达蛋白,而IL-1β是评估软骨炎性程度的重要指标。与空白组比较,COL-Ⅱ模型组表达相对较少,经过干预后的毫火针组表达增多,而单纯的毫针组改变不明显。IL-1β的表达情况则相反,在模型组表达较多,经治疗后的毫火针组明显减少,单纯的毫针治疗不及毫火针治疗效果好。见图3。

图3 免疫组织化学分析软骨损坏情况(200×)

2.6 甲苯胺蓝染色评估各组软骨形态

各组大鼠的膝关节软骨组织经包埋、脱蜡、切片及染色后镜下观察可知,空白组关节面较平滑,以透明软骨为主。模型组的关节面出现了崩塌,后期的恢复绝大部分以纤维软骨为主,极易发展为骨关节炎并持续循环加重。经毫火针治疗的关节软骨平面明显优于模型组。与毫火针组比较,单纯的毫针治疗效果不及毫火针。见图4。

图4 甲苯胺蓝染色评估各组软骨形态(200×)

3 讨论

关节软骨是覆盖于骨关节表面的透明软骨,成人厚度约为3 mm[13]。从软骨表面到干骺端依次分为浅表区、中间区、深区和钙化区4层[14]。主要由软骨细胞、胶原、蛋白聚糖和大量的水组成,光滑有序的排列降低了运动时的摩擦系数,减轻磨损程度。因缺乏潜在的干细胞龛和软骨前体细胞,软骨细胞数量少和丰富的细胞外基质包绕迁移能力弱,所以软骨损伤后的自然修复以纤维软骨为主,最终会进展为骨性关节炎导致关节疼痛和功能障碍[15-16]。软骨稳态就是利用一切方法让软骨保持在一个相对平稳的状态。二型胶原是软骨组织的特异性表达蛋白,他的表达从一定程度上表达了软骨状态的优劣[17]。白介素-1β是对关节炎性程度的一个直接切入点,通过不同的干预方式综合观察软骨的特异性表达蛋白和炎性程度,可以对KOA的进程和转归进行一个粗略的评估[18]。

膝骨性关节炎在中医学中隶属于“膝痹”“骨痹”等范畴。病因病机表现为风寒之邪侵袭经络,瘀滞不通,发而为病。临床常见的症状有双膝冷痛,遇寒加重,得温痛减[19]。治寒以热,毫火针既有普通针刺的疏通作用,又具备了火针的温热之性,在临床治疗中取得较好的效果[20-21]。李志娟等[12]的研究中,把火针的这种治疗作用总结为“破”和“立”的关系,通关打破一个旧的、病理的状态,引发一系列的级联反应,最终创立一个新的,生理的稳态,来达到一个健康水平。王研[19]运用毫火针留刺法对30例寒湿痹阻型KOA患者进行治疗,结果显示,毫火针组的治疗总有效率为89.66%,高于单纯普通毫针治疗的70%。并且毫火针组的VAS评分、Lysholm膝关节评分和中医证候群评分均高于普通针刺组。上述可知,毫火针能有效缓解膝关节疼痛、功能障碍,并且在一定程度上延缓其病理进程。

在本实验结果中也发现,毫火针不仅可以缓解疼痛和功能障碍,在减轻炎症和病理形态的损伤方面,也有一定的作用。从行为学角度而言,毫火针的治疗可以明显缓解因炎症导致的步态和爪压的异常改变。从分子生物学角度来看,软骨特异性表达蛋白COL-Ⅱ和SOX9在毫火针治疗后都有明显的高表达,而炎性相关指标IL-1β和TNF-α均显著下降。从病理形态学来看,模型组的关节面粗糙,后期的恢复绝大部分以纤维软骨为主,极易发展为骨关节炎并持续循环加重。经毫火针治疗的关节软骨平面明显改善。前述可知,毫火针这一疗法不仅可以改善KOA患者的功能,在生理病理上对骨关节炎的防治作用也是有积极意义,可以在临床中普遍开展并推广。

综上所述,本研究用木瓜蛋白酶注射关节造成SD大鼠体内KOA模型,探讨毫火针对KOA的软骨稳态维持作用。毫火针可以有效促进二型胶原的表达,同时还可以减轻SD大鼠的炎性损伤。其发挥作用的具体机制可能是激活SOX9通路进而影响软骨的稳态,但其中的具体关系还需要进一步地研究和探索。