氢气对MIRI 患者心肌细胞线粒体ROS 生成抑制和质量控制系统调控的作用及其机制研究进展

王家威，左越，宫哲轩，刘福林，刘彤彤

河北大学附属医院心脏外科，河北保定 071000

氢气在很长的一段时间内被认为是一种无功能的生物惰性气体，对人体内的生物活动不产生任何效应［1］。但是日本学者OHSAWA 等［2］在2007年的一项研究中发现氢气在体外环境中可以选择性地清除具有细胞毒性的活性氧（ROS）分子的现象，并且提出了氢气选择性抗氧化和细胞保护作用的新假说，使得氢气的生物学意义被重新重视起来。心肌缺血再灌注损伤（MIRI）一直是急性心肌梗死（AMI）患者在冠脉复流后继续造成心肌损伤的重要原因之一，近年来有研究表明线粒体活性氧（mROS）的产生［3］和线粒体功能障碍［4］是普遍存在于各类组织缺血再灌注损伤病理过程中的重要驱动因素。氢气作为分子量最小的气体，具有稳定共价键的非极性分子，呈电中性，这些特性使得氢气可以通过自由扩散的方式进入线粒体等亚细胞间隔参与分子活动［5］，从而抑制线粒体内ROS 的生成，调控线粒体质量控制系统的稳定，通过上述调控机制改善MIRI。现就氢气对MIRI 患者心肌细胞线粒体ROS 生成抑制和线粒体质量控制系统调控的作用及其机制研究进展情况综述如下。

1 氢气对MIRI 患者心肌细胞线粒体ROS 生成抑制作用及其机制

氢气对诸如羟自由基（·OH）在内的ROS清除作用一直被认为是氢气抑制细胞氧化应激的重要因素之一，但是氢气直接清除ROS 的理论仍有局限。一方面外体外实验中氢气与ROS 中诸如·OH 的反应速度比谷胱甘肽、葡萄糖或其他生物分子的反应速度慢很多［6］；另一方面氢气在对帕金森、内风湿关节炎、肥胖和糖尿病等先天或慢性疾病某些方面的改善无法完全用清除ROS来解释［7］。在哺乳动物的线粒体中，目前已发现了11个与底物氧化等有关的产生ROS 的位点［8］，其中大部分的ROS 来源于呼吸链（ETC）上的电子泄漏，而半醌（QH-）则被认为是其中的一个重要的纽带，因为过量或者不适当地产生QH-可能是超氧化物的主要来源之一［9-10］。对此，ISHIBASHI 等［7］提出了氢气干预ROS 生成上游事件中的线粒体复合体催化中心的反应从而干预ROS生成行为的猜想。

1.1 抑制线粒体复合体Ⅰ中ROS 的生成 线粒体复合体Ⅰ又被称为NADH-泛醌还原酶，是线粒体链上最大的膜蛋白复合体，是呼吸链的入口，主要由突入线粒体基质中的长臂和嵌入线粒体内膜上的横臂两部分组成，其主要作用是将电子从NADH 传递到偶联的辅酶Q（即泛醌），同时将H+从线粒体的基质侧泵入膜间隙侧［11］。线粒体复合体Ⅰ在生物学上与［NiFe］-氢酶有着密切的关系，［NiFe］-氢酶的功能是催化质子的可逆转化，使微生物能够将氢气作为能源进行生命活动［12］，也因此线粒体复合体Ⅰ被认为拥有一些氢酶的性质。复合体Ⅰ按照功能分类为：长臂远端的N 模块、长臂近端对接到横臂上的Q模块以及横臂上的近端泵模块（PP）和远端泵模块（PD）；其中，Q 模块将N 模块氧化NAPDH 产生的电子经泛醌结合位点（IQ）传递给线粒体膜间隙中的泛醌，生成二氢泛醌（QH2）或QH-（介于泛醌和二氢泛醌之间的中间体）［13］。在哺乳动物的线粒体复合体Ⅰ中，Q 模块中的IQ被认为是氢气抑制复合体Ⅰ中ROS的生成的关键位点，氢气在IQ通过QH-的影响活化，与附近的碱和酸性氨基酸发生协同反应，裂解成质子和电子（类似于［NiFe］-氢酶中氢气裂解反应过程中的情况7］），其中电子逆向通过Q 模块转移至N模块，以自由基的形式还原氧化的FMN（和/或将NAD + 还原为NADH），质子则通过正向转移将QH-还原为QH2，避免了产生ROS的有害电子泄露［7］。

1.2 抑制线粒体复合体Ⅲ中ROS 的生成 与复合体Ⅰ的结构不同，哺乳动物的复合体Ⅲ的结构是一个对称的二聚体，每个单体有11 个亚基，其中具有催化活性的亚基是细胞色素b（包括高电势bH和低电势bL）、细胞色素c1和被铁硫蛋白包裹的高电势FeS 辅基［14］，复合体Ⅲ主要作用是通过Q 循环将来自线粒体复合物Ⅰ和Ⅱ的电子转移至复合体Ⅳ［15］。对比较为复杂机制不明确复合物Ⅰ，复合物Ⅲ产生ROS 的机制早已经有了被大众所信服的解释：复合体Ⅲ在通过Q 循环传递电子的过程中，QH2氧化位点（Qo）上产生的携带单电子的不稳定QH-可以在复合物Ⅲ中自由移动，直接将单电子传递给O2，并通过非酶反应形成ROS（一方面，缺血期低氧诱导半醌将电子传递给O2，另一方面，再灌注期大量进入线粒体中，这两方面的因素共同促进了有害ROS 的产生［7］。比如QUINLAN 等［16］发现，抗霉素A 可以特异性地阻断复合体Ⅲ的泛醌还原位点（QI），导致Qo位QH-上的电子停滞，从而与O2反应生成ROS；而豆蔻素和霉唑作为Qo位点的特异性抑制剂，可以阻断QH2与Qo位点的结合，阻止电子向复合体Ⅲ的转移，从而阻止复合体Ⅲ中ROS 的产生。这一其具体的机制可能是由于阻断了从Q 循环中生成QH-的电子转移［17］，更加佐证了上述的解释。因此，虽然复合体Ⅲ与［NiFe］-氢酶并没有太大的联系，但是目前的研究证据可以说明氢气干预复合体Ⅲ中ROS 产生的可能机制：即氢气可能直接与Qo位上的不稳定QH-发生非酶促反应，从而抑制超氧化物的产生。

总之，在Toru Ishibashi提出的假设描述中，氢气可能同时作为氧化剂和还原剂，在产生ROS 的关键位点活化，通过将质子传递给包括QH-在内的泛醌物种或是将电子沿电子转移途径逆向传递给ETC上游的电子供体，阻止ROS 产生位点两个方向上的电子流动，从而防止在缺血再灌注损伤的情况下ETC 过早泄漏产生ROS 的有害电子，进入大量有害ROS产生的恶性循环中［7］。

2 氢气对MIRI 患者心肌细胞线粒体质量控制系统调控的作用及其机制

在机体内，每个细胞中的全部线粒体构成了一个动态的网络，并由“线粒体质量控制系统”去调控，该系统是通过线粒体的融合、分裂、自噬、线粒体生物发生和线粒体未折叠蛋白反应等方式维持细胞内线粒体数量和质量相对稳定的复杂动态生理过程［18］。有关氢气干预线粒体质量控制系统的研究目前主要集中在以下几个方面：调控PINK1/Parkin 信号 通 路［19］、Drp1 和Mfn2 信号 通 路［20］、FUNDC-1 通路［21］、未折叠蛋白反应［22］、激活PGC-α 促进线粒体生物发生［23］。

2.1 调控PINK1/Parkin 和FUNDC-1 介导的线粒体自噬途径 PINK1/Parkin 途径和FUNDC-1 途径都属于线粒体自噬途径。线粒体自噬是一种选择性的自噬，是细胞内的自噬小体精准的识别衰老或受损的线粒体，并向其运送至溶酶体内清除的过程，从而防止诸如缺血再灌注损伤的病理过程中的线粒体诱导的细胞凋亡的进展，维持心肌细胞的能量平衡及存活。

有关线粒体自噬的机制，目前研究最多的就是PINK1/Parkin 途径。在正常细胞内，PINK1 定位于线粒体外膜（OMM），然后经线粒体转位膜复合物转移至线粒体内膜（IMM），被内膜上的基质加工肽酶（Mpp）和早老素相关的菱形蛋白（Parl）迅速降解；然而，当线粒体在应激状态下时，线粒体膜电位的降低通过影响Mpp 和Parl 以及转位蛋白的活性来干扰PINK1 的转运和降解，导致PINK1 前体在OMM 上积累［24］。积累的PINK1通过招募并磷酸化Parkin 进而使包括线粒体rho GTPase 1（Miro1）、线粒体融合蛋白1/2（Mfn1/2）和电压依赖性阴离子通道（VDAC1）在内的线粒体自噬蛋白经过泛素化而激活［25］；另外，PINK1 也可以直接磷酸化TANK 结合蛋白1（TBK1），进而进一步激活其他线粒体自噬受体，比如核点蛋白（NDP52）、p62和视神经磷酸酶（OPTN）。所有这些受体含有微管蛋白1 轻链3（LC3）相互作用区（LIR 模体）和泛素相互作用区，可以促进泛素化的线粒体和自噬小体之间的融合，从而清除功能障碍的线粒体18］。目前，普遍认为在缺血期时增强量均有所提升，而在沉默PINK1基因后，氢气对缺血再灌注损伤的保护作用受到了逆转［26］。在另一项研究［19］中发现了氢可以通过促进线粒体自噬活性，增强PINK1、Parkin 和VDAC 的表达，促进Lc3-I向Lc3-II 的转化，降低p62 的表达，从而改善内毒素刺激后线粒体功能障碍。

FUNDC-1 途径也是线粒体自噬途径中的一员，Fun14 结构域蛋白1（Fundc1）是一种具有3 个跨膜结构域的OMM蛋白。在低氧等应激条件的诱导下，Fundc1 介导的线粒体自噬主要通过磷酸化（或去磷酸化）修饰来激活。到目前为止，已经发现了三个磷酸化位点：Tyr18、Ser13 和Ser17；Ser13 和Tyr18 的磷酸化抑制Fundc1-LC3 的相互作用和随后的线粒体自噬，而Ser17的磷酸化会增强线粒体自噬18］。正常的细胞环境中，FUNDC-1 介导的自噬会被Tyr18 的磷酸化所抑制［27］；而在缺血再灌注损伤中，这种抑制的作用会减弱，从而使FUNDC-1 发挥其诱导自噬的作用。在氢气干预下，败血症模型中小鼠肝脏细胞内的p-18-Fundc1 蛋白的含量相较于没有氢气干预的模型组会更明显的减少，同时氢气也会促进FUNDC-1 与LC3 的相互作用，增强原本受到抑制的FUNDC-1介导的自噬［21］。

另外，同属于线粒体自噬途径的BNIP3/NIX 途径及其所属的BCL-2家族在细胞凋亡的机制中已经有了较为全面的研究，氢气的干预机制也有了比较多的探讨，但是目前仍没有关于氢气干预BNIP3/NIX途径的相关报道。

2.2 调控Drp1 介导的线粒体分裂 线粒体膜电位对线粒体功能的维持有着非常重要的意义，在细胞缺氧或应激的过程中，线粒体膜电位的下降会导致线粒体功能障碍，而氢气处理可以通过增加线粒体膜电位来改善线粒体功能［19］，其机制可能使通过线粒体分裂来控制的。线粒体分裂则可以产生新的线粒体，允许线粒体的重新分布，并促进受损线粒体的分离。线粒体的分裂是一个不对称的过程，它使分裂后的其中一个子体线粒体具有高膜电位，并很快重新融合到细胞内线粒体网络中，而另一个子体线粒体具有低膜电位，通常经过PINK1/Parkin 线粒体自噬途径清除［28］。适当的线粒体分裂产生许多子线粒体，正如前文所说，部分子线粒体继续参与进细胞内的线粒体网络为心肌细胞提供ATP，其他的子线粒体以线粒体自噬的方式清除。在缺乏Drp1 基因的个体中，发现了线粒体呼吸功能受损，线粒体吞噬功能受到抑制，线粒体通透性转换孔（mPTP）开放的易感性增加，以及细胞凋亡率或坏死率增加的现象，但是在基线水平上，Drp1 的过表达又会诱导线粒体功能障碍和心肌细胞的凋亡［29］。因此Drp1 在MIRI的过程中扮演的角色仍然不明确，是否加重或改善心脏再灌注损伤及其可能的机制仍需进一步研究。有意思的是在肺脓毒症的模型中，氢气干预后Drp1的表达量水平较模型组明显的下降，但是与对照组的差距却并不明显［20］，这表明氢气可能是在一定程度上逆转缺氧应激带来的过度的有害线粒体分裂，以维持在正常生理环境的水平来减轻细胞的损伤。

2.3 调控Mfn2途径介导的线粒体融合 线粒体融合使线粒体内物质能够在线粒体之间交换，与线粒体分裂和自噬一起清理受到损害、老化的线粒体，保证细胞内线粒体本身的稳定以保证细胞功能的正常运转。线粒体融合是由神经营养因子1（OPA1）、线粒体融合蛋白1/2（Mfn1/2）3 种蛋白同时作用的过程，其中Mfn1 和Mfn2 分别诱导IMM 和OMM 的融合［30］。目前有关氢气干预线粒体融合途径的报道较少，但是DONG 等［20］发现，在肺脓毒症的模型中，氢气干预后Mfn2 的表达水平与正常的组织没有明显的差别，但相较于模型组却有着明显的提升。这表明，在脓毒症存在的情况下，氢处理可以使Mfn2 的水平维持在正常的范围以促进线粒体的融合，从而减轻应激损伤导致的细胞凋亡。但是除了其介导线粒体融合的作用外，Mfn2 还有着其他的作用，比如作为Parkin的线粒体受体介导心肌细胞的线粒体自噬［31］。目前Mfn1/2 在心脏缺血再灌注损伤中的作用引起了激烈的争论，因为无论其表达量的增多还是减少都能在一定程度上提供心脏的保护，氢气在这一机制中的作用也不明确，可能是通过线粒体融合或是线粒体自噬这两种方式减轻心肌细胞的损伤，目前只能说为氢气干预MIRI的研究提供了一条新的方向［18］。

2.4 调控线粒体未折叠蛋白反应 线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）是在诸如氧化应激、缺血再灌注损伤、线粒体DNA 或代谢功能受损、以及线粒体蛋白平衡紊乱这些应激环境下，促进线粒体伴侣蛋白和蛋白水解酶的表达，从而恢复线粒体蛋白稳定的过程，是属于线粒体质量控制的一员［32］。目前发现在哺乳动物中一共有3个转录因子参与了线粒体未折叠蛋白反应的过程，它们包括ATF5、ATF4 和CHOP，但是没有直接的证据证明氢气可以通过上述几种转录因子激活线粒体未折叠蛋白反应。SOBUE 等［22］发现，氢气可以使组蛋白H3K27去甲基酶或染色质重组，随后通过H3K27 或H3K9 甲基化状态的改变而激活线粒体未折叠蛋白反应，这提示了氢气可能通过其他的途径来激活线粒体未折叠蛋白反应的通路；同时他们也给出了一个后续的方向，即氢气可能通过使JMJD3（一种H3K27去甲基酶）表达的上调来激活线粒体未折叠蛋白反应。

2.5 调控线粒体生物发生 线粒体生物发生是一种建立在线粒体分裂、生长和增值基础上的线粒体数量增多的过程，是线粒体周转的一种再生机制，其主要目的是为了及时补充细胞内线粒体的数量以提供充足的能量满足细胞活动。线粒体生物发生是一个复杂的过程，需要核基因组与线粒体基因组的紧密配合，它们分别转录各自对应的线粒体蛋白质以促进线粒体生物发生的进展，以提高线粒体的质量水平。核基因组中编码的线粒体蛋白的表达受转录因子和转录共激活因子的调控，其中研究最广泛的与线粒体生物发生相关的转录辅助激活因子是PGC-1α，它可以激活如核呼吸因子NRFs（包括Nrf1和Nrf2），以及雌激素相关受体（Err）家族蛋白在内的各种转录因子［33］。NRFs 主要参与线粒体呼吸亚基和线粒体转录因子的表达，其中转录因子包括线粒体转录因子A（TFAM）和转录因子B（TFBM）［34］。在缺氧等应激条件下，PGC-1α、Nrf2和TFAM的表达水平升高，而氢气处理进一步增加了这些蛋白的表达水平［35］，这说明氢气可以在一定程度上增强线粒体生物发生，增加细胞中正常功能线粒体的数量，缓解应激造成的线粒体功能障碍，但是其详细的作用机制仍然不明，可能是在上游阶段促进PGC-1α 的磷酸化和去乙酰化来激活下游的信号通路。

综上所述，氢气除了通过清除ROS 来缓解氧化应激的作用之外，也可能直接干预线粒体产生致病性ROS 的上游阶段，选择性的抑制缺血再灌注损伤过程中的额外ROS 产生来减轻氧化应激的影响［7］。除此之外，线粒体质量控制系统是最近提出来的一个新概念，其系统的失衡被认为是导致MIRI的一个重要的影响因素［4］。有不少报道都提出了氢气参与在应激或是缺氧条件下线粒体质量控制系统自我调控的过程，通过PINK1/Parkin 信号通路、Drp1 和Mfn2信号通路、FUNDC-1通路、未折叠蛋白反应、激活PGC-α 促进线粒体生物发生等方式改善MIRI，这一过程从结果来看是有益的，但是其具体的分子机制仍然不明确；线粒体质量控制系统的调控是复杂的动态生理过程，各路径之间也有着相互的影响，阐明氢气在参与线粒体质量控制系统调控的具体作用机制是可能一个未来研究的重点方向。