基于BP人工神经网络的酿酒酵母发酵培养基优化及其水解物对真菌毒素吸附研究

尹 鹏, 杨芸芸, 赵一凡, 杜 稳, 李 秋, 彭君建, 刘虎军

(国家粮食和物资储备局科学研究院1,北京 100037) (中国计量大学2,杭州 310018) (山东鲁花集团有限公司3,莱阳 265200) (江苏丰尚油脂工程技术有限公司4,扬州 225000)

霉菌在自然界中种类繁多,分布广泛,是导致粮食、饲料霉腐变质的主要因子[1]。真菌毒素是部分霉菌生长过程中产生的有毒次级代谢物。据联合国粮农组织(FAO)统计,全球每年有25%的农产品受到真菌毒素污染[2],由此引起农产品和饲料的损失达数百亿美元,其中我国是世界上受真菌毒素污染最严重的国家之一,每年真菌毒素污染造成的粮油损失数量较大,经济损失达数百亿美元[3],给粮食安全与人类健康带来严重威胁。因此,研发包括阻控畜禽中毒的微生态制剂等在内的真菌毒素防控技术和材料具有十分重要的现实意义[4,5]。

微生态制剂主要由乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、放线菌等几大类微生物组合而成[6],经发酵培养、后加工等工艺制成的生物制剂或活菌制剂。酿酒酵母具有改善畜禽消化道菌群平衡、增强机体免疫力、提供丰富的营养物、无毒、无副作用等大量优点,农业部公告第2038号规定了酿酒酵母及其水解物均可作为发酵饲料原料,酿酒酵母可作为饲料添加剂。酿酒酵母属于一种单细胞微生物,其特点是耐酸性较强,属于兼性厌氧型真菌,含有大量核酸、蛋白质和丰富的风味物质,经发酵、水解、干燥等工艺可获得酵母提取物、酵母培养物以及酵母水解物等酵母类微生态制剂。酵母水解物可减少或者替代抗生素在断奶仔猪饲粮中的使用,这为研发无抗饲料提供了有力的理论依据和数据支持[7]。酿酒酵母水解后,细胞壁中的甘露低聚糖、葡聚糖等成分充分暴露,能够与真菌毒素有效结合,有效阻止被体内吸收。Yiannikouris等[8]研究表明酵母细胞壁可以有效减少大鼠体内对AFB1的吸收。朱荣华[9]发现酵母来源细胞壁的酯化葡甘露聚糖可以有效地吸附玉米赤霉烯酮类真菌毒素。加之酵母水解物在改善牲畜胃肠道菌群平衡和动物饲料适口性、增强禽畜免疫力、无毒可再生、不会造成环境污染和抗药性等方面的优势[10],因此酵母水解物对真菌毒素的阻控方面具有重要的应用潜力[11]。

培养基组分、发酵条件以及各因素之间的交互作用是微生物生长的关键,因此在规模化生产之前需要对各个因素进行探索和优化。目前针对培养基的优化主要采用单因素、正交设计、响应面优化等方法[12-15]。但是发酵过程中各营养成分之间具有复杂非线性,传统的方法在处理非线性问题时具有一定的局限性。而人工神经网络算法( Artificial Neural Network,ANN)具备学习能力、自适应能力和自组织能力,通过构建数学模型并不断调整内部大部分节点间互相连接关系表现出一些技能特性,在信号处理、自动控制、模式识别和预测分析方面解决了许多其他机器系统很难处理的问题,能够反映复杂的非线性关系,具备全局预测能力,BP 算法是神经网络模型中最常用的一种算法[16-18]。

研究以实验室前期筛选得到的一株性能优良的酿酒酵母菌株(ASAG-39)作为出发菌株,通过单因素实验对发酵过程中需要的碳源、氮源以及无机盐的种类、添加量进行初步筛选,进一步建立BP人工神经网络深度学习模型,遗传算法进行全局寻优得到最佳的碳源、氮源以及无机盐的添加量,预测酿酒酵母发酵的最大OD600,通过实验验证模型的可靠性。同时,研究了酿酒酵母水解物对部分真菌毒素的吸附效果,从而为下一步研发酵母水解物在真菌毒素阻控方面的新材料和技术提供了参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

酿酒酵母(ASAG-39)由国家粮食和物资储备局科学研究院实验室筛选保藏。

酵母粉、蛋白酶:生物试剂;蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米将干粉、KH2PO4、MgSO4、ZnSO4、柠檬酸、玉米赤霉烯酮标准品(Zearalenone,ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品(Deoxynivalenol,DON)、黄曲霉毒素B1标准品(黄曲霉毒素B1,AFB1):分析纯;甲醇、乙腈:色谱纯。

固体培养基:葡萄糖质量分数2.0%、酵母粉质量分数1.0%、蛋白胨质量分数2.0%、琼脂质量分数2.0%,115 ℃灭菌质量分数20 min。

种子培养基:葡萄糖质量分数2.0%、酵母粉质量分数1.0%、蛋白胨质量分数2.0%,115 ℃灭菌20 min。

初始(发酵)培养基:葡萄糖质量分数2.0%、酵母粉质量分数1.0%,调节初始pH 6.0,115 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

HPS-400生化培养箱,ISF1-X恒温摇床,eppendorf 5424R台式高速离心机,UZ-2450紫外-可见分光光度计,Waters 2495高效液相色谱,荧光检测器,紫外检测器,C1810 nm, 5 μm, 4.6 mm×150 mm色谱柱。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵条件优化

取冻存的酿酒酵母ASAG-39在固体培养基活化,30 ℃条件培养40～72 h。取单一菌株经种子培养基30 ℃、210 r/min培养12 h后,5%的接种量转接至初始培养基中,按照控制变量法依次确定最佳发酵时间、初始pH、温度、转速。

1.3.2 培养基的优化

单因素实验:在已确定的发酵条件的基础上,改变单一因素,分别对碳源、氮源及无机盐种类及添加量进行优化。

多因素实验:在单因素实验的基础上,利用软件Design-expert 8.0.6设计中心组合,测定发酵结束后发酵液的OD600。建立BP人工神经网络模型,基于实验数据训练模型,使其能够较精确地预测实际值(实验值),优化好的网络与遗传算法结合进行寻优最佳配方。

1.3.3 BP人工神经网络模型和遗传算法

采用反向传播法建立人工神经网络(ANN)模型,整个模型包括3个层次:输入层、隐含层、输出层。基于软件Design-expert 8.0.6设计中心组合,经过实验获得的30组数据为样本,randperm函数打乱数据增加数据的随机性,mapminmax函数归一化、反归一化数据,newff构建初始网络net,train函数对神经网络net的数据进行训练。error和R2反映模型的可靠性。

error=abs(output_prediction-output_test)./output_test;R2=(N×sum(output_prediction.×output_test)-sum(output_prediction)× sum(output_test))^2/((N×sum(output_prediction).^2)-(sum(output_prediction)^2)×(N×sum(output_test).^2)-(sum(output_test)^2))。式中:error为相对误差;R2为拟合系数;output_prediction为模型预测输出数据;output_test为实验数据;N为训练数据的组数;sum为求和函数。

将拟合效果较好(R2>0.99,error<0.05)的模型进行下一步遗传算法寻优。遗传算法是可直接对结构对象进行相关操作,不存在求导和函数连续性的限定,具有全局寻优的优势。综合考虑精度、收敛速度以及计算规模等,将每代染色体种群设为50,在求出所有染色体适应度值之后,通过轮盘选择法对种群进行选择,最大迭代次数100次,采用单点交叉和单点变异,交叉概率为0.5,变异概率为0.08。在此基础上反归一化输出最优值以及相应的个体。

1.3.4 OD600测定

菌体OD600的测定:取2 mL的发酵液于2 mL的离心管中,12 000 r/min离心5 min弃去上清液,用去离子水洗涤菌体2～3次,适当稀释后用可见-紫外分光光度计测定吸光度OD600。

1.3.5 酿酒酵母水解物制备和体外毒素吸附实验

酿酒酵母的水解方法[19]:取一定量的干酵母于80～95 ℃水浴,热激30 s。以酵母干物质的质量计,加入质量分数1‰～5‰的柠檬酸,在45～55 ℃,200 r/min磁力搅拌反应6～12 h,使其自溶。以酵母干物质的质量计,添加质量分数1‰～5‰的复合酶,调节pH 5～7,在55～65 ℃,200 r/min磁力搅拌使其酶解6～12 h,将其进行冷冻干燥备用。

酵母水解物对毒素吸附:取毒素标品加去离子水制得质量浓度分别为10 μg/mL的ZEN和DON溶以及5 μg/mL的AFB1溶液,pH调整为7.0,添加不同浓度的酵母水解物,37 ℃吸附2 h,反应结束后在转速12 000 r/min离心5 min,取上清液1 mL过滤膜,液相色谱检测其中的毒素含量。

1.3.6 ZEN 、DON、AFB1的检测[20,21]

ZEN的检测方法及条件:

流动相:体积分数50%水,体积分数50%乙腈;流量:1 mL/min;检测器:荧光检测器,激发波长274 nm,发射波长440 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。

DON的检测方法及条件:

流动相:体积分数80%水,体积分数20%甲醇;流量:1 mL/min;检测器:紫外检测器,218 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。

AFB1的检测方法及条件:

流动相:体积分数50%水,体积分数50%甲醇;流量:0.8 mL/min;检测器:荧光检测器,柱后光化学衍生化,激发波长360 nm,发射波长440 nm;柱子温度:40 ℃;进样量:10 μL。

2 结果与讨论

2.1 发酵条件的优化

对培养基进行优化之前首先进行发酵条件的选择,以OD600为测试指标,分别对发酵时间、pH、温度以及摇床转速进行优化。结果表明最佳发酵条件为:发酵时间36 h,发酵温度30 ℃,pH 6.0,摇床转速210 r/min,在此基础上进行培养基单因素优化。

2.2 单因素优化酵母培养基

碳源不仅为细胞内分解代谢提供小分子的碳链骨架,同时为细胞代谢提供生命活动所需要的能量。在初始培养基的基础上,研究了单糖、二糖以及多糖淀粉的添加量对酿酒酵母生物量的影响,通过设置不同浓度的碳源,将最适添加量汇总(表1)。实验表明,最适合用蔗糖作为酿酒酵母的碳源,当蔗糖、酵母粉、蛋白胨质量浓度分别17.5、1.0、2.0 g/100 mL时,OD600值最大为25.8。

表1 不同碳源对酵母生长的影响

氮源是微生物生长过程中蛋白质等合成的原料,适当的氮源能够促进微生物的生长,对该株酿酒酵母培养过程的氮源进行了研究,通过设置不同浓度的氮源,将最适添加量汇总(表2)。实验表明,酵母粉较蛋白胨更加适合作为氮源,当蔗糖、酵母粉质量浓度分别为17.5、10.0 g/100 mL时,OD600值最大为28.92。

表2 不同氮源对酵母生长的影响

无机盐不仅能够为微生物的生长提供所需要的微量元素,而且是微生物合成代谢过程中很多酶反应过程的激酶。KH2PO4、MgSO4在酵母生长过程中,均是代谢过程中重要的激酶[17]。因此,对该株酿酒酵母培养基中无机盐的组分进行优化,通过设置不同浓度的无机盐,将最适添加量汇总(表3)。实验表明,当蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4质量浓度分别为17.5、10.0、0.1、0.6 g/100 mL时,OD600值最大为32.78。

表3 不同无机盐对酵母生长的影响

2.3 多因素优化酵母培养基

微生物发酵培养基多因素的优化一般采用正交实验、响应面优化等方法[6-9]。但由于发酵过程中各营养成分之间对酵母生长代谢具有高度非线性,即各营养成分在微生物的生化代谢和生长过程中非常复杂,不是简单的线性影响,因此传统的正交、响应面方法在处理高度非线性问题方面具有一定的局限性。而BP人工神经网络能够反映复杂的非线性关系,具备深度学习和广泛预测能力,结合遗传算法可以更加精确推断最佳培养基配方。模型运行的本质是先利用样本数据建立起神经网络模型,然后施加输入,通过模型运算得到预测结果。

2.3.1 中心组合实验设计

以提高酿酒酵母的生物量为目标,根据单因素实验确定蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4的4个因子,借助Design-expert 8.0.6软件进行实验组数为30的中心组合实验设计,分别取值培养基组分蔗糖质量浓度12.5、15.0、17.5、20.0、22.5 g/100 mL,酵母粉质量浓度5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g/100 mL,KH2PO4质量浓度0、1、2、3、4 g/L,MgSO4质量浓度2、4、6、8、10 g/L(表4),按照设计的培养基组成进行实验,实验结果汇总见表5。

表4 中心组合设计各因素取值范围

表5 不同培养基组分的生物量

2.3.2 人工神经网络模型的建立与遗传算法优化

实验选择的BP神经网络的拓扑结构输入层数-隐藏层数-输出层数为4-5-1建立初始网络模型,随机打乱数据之后,选择前20组数据来训练网络模型,另外10组数据用来验证模型的可靠性,其中设置参数学习效率0.1,迭代次数1 000次。通过20组数据训练模型见图1a,预测值与实验值(真实值)之间的相对误差在5%之内。其余10组数据对模型进行验证见图1b,其预测值与真实值之间的相对误差5%以内,且模型运行输出的拟合系数R2为0.997,模型可以较好的模拟实验值,表明该网络能够较好模拟培养基组分与生物量之间的关系。

图1 BP神经网络学习和预测能力

2.3.3 遗传算法寻找最优解

在模型可靠的基础上,遗传算法寻优结果见图2,经过运行能够看出当迭代42次左右就能够达到收敛,此时最佳配方蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4质量浓度分别为18.90、8.90、0.05、0.80 g/100 mL,此时生物量OD600能达到38.9。通过实验进行验证,按此配方经过种子培养、发酵,测得发酵液生物量OD600为37.1,偏差为4.6%,在相对误差5%的范围内,与单因素(表3)最大生物量OD60032.78相比增加了13.2%。

图2 遗传算法适应度曲线

2.4 酵母水解物对真菌毒素的体外吸附研究

酵母经自溶、酶解等处理可以获得水解物,酵母水解物是一种营养价值高、诱食性强的绿色饲料添加剂,具有良好的促生长、增强免疫、抗氧化、保护肠道等生物活性功能[22]。其中,酵母水解物所含有的细胞壁多糖,能够与毒素、病毒等病原结合,增强其免疫原性[23]。将该株酿酒酵母经水解获得酵母水解物,在体外研究其对真菌毒素的吸附效果。结果(见图3)表明,当酵母水解物的质量浓度是4、4、8 mg/mL,单位水解物对ZEN、DON和AFB1的削减量达到最大,分别615.4、46.0、434.6 μg/g,该酵母水解物对真菌毒素ZEN和AFB1吸附效果较好。

图3 酵母水解物对3种毒素的吸附效果

3 结论

对一株酿酒酵母进行了发酵培养基的优化,通过模拟肠道内中性的水环境,对其水解物进行了几种真菌毒素的吸附研究,水解物对ZEN和AFB1吸附性能良好。通过单因素实验、中心组合实验设以及人工智能手段,优化得到最佳的培养基配方:蔗糖、酵母粉、KH2PO4、MgSO4质量浓度分别为18.90、8.90、0.05、0.80 g/100 mL,预测的OD600为38.9,经验证与该配方下实际OD600的37.1偏差4.6%,提高了13.2%,验证了模型的可靠性。为微生物发酵过程培养基的精准优化提供了一种可靠方法。

酵母细胞壁多糖或改性的细胞壁多糖对部分真菌毒素具有良好吸附效果,酵母水解物是经自溶和酶解之后不做进一步的质壁分离,直接进行干燥获得的产品。该物质既具备良好的细胞质的营养物质,也具备细胞壁的活性功能。因此,探索酿酒酵母水解物对真菌毒素的体外吸附模拟,该酵母水解物对ZEN和AFB1最大吸附量分别为615.4、434.6 μg/g。

下一步可以继续优化水解物的吸附性能并开展该株酵母水解物的动物实验,包括对实验动物生长性能的影响、对肠道菌群的影响以及对免疫器官的影响,以期获得该株酵母水解物能够应用的数据参考。