大豆-乳清双蛋白对大鼠体内免疫的调节作用

梁得福, 孟维洪, 许庆鹏, 舒 欣, 庄柯瑾,2, 张东杰,3,4

(黑龙江八一农垦大学食品学院1,大庆 163319) (农业农村部农产品及加工品质量监督检验测试中心2,大庆 163319) (黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室3,大庆 163319) (国家杂粮工程研究技术中心4,大庆 163319)

膳食营养是关乎机体健康的主要因素,众多研究表明,膳食可影响机体的免疫功能[1]。膳食结构有着多种组成,但膳食中的主要组成成分是一定的,膳食中一定要包含碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素等物质[2]。机体的免疫调节与氨基酸的排列组成息息相关,且膳食中的蛋白质也成为了免疫调节制剂的研究热点[3]。膳食中蛋白来源主要分为3类,分别是动物源蛋白、植物源蛋白和海洋类蛋白[4]。动物源蛋白和植物源蛋白易获取且价格低廉,动物源蛋白主要来源于乳类、肉类和蛋类,植物源蛋白主要来源于粮食作物[5]。粮食作物中蛋白质含量较高的是大豆,大豆蛋白的活性功能甚多,如提高免疫力的作用[6]。动物源蛋白中乳液常被添加于膳食中,乳清蛋白是乳液中含量较多的一种蛋白质,乳清蛋白有益于可调节人体机体免疫等功能[7]。

大豆蛋白作为饲料饲喂金黄色葡萄球菌感染的老年小鼠后,可显著提高机体的免疫球蛋白含量和降低体内炎症因子的浓度,因此大豆蛋白可提高机体的体液免疫功能[8]。刘明美等[9]将大豆蛋白采用灌胃的模式饲喂小鼠28 d,与未饲喂大豆蛋白的小鼠相比,白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和脾脏指数均显著性提升,表明大豆蛋白可改善机体的免疫功能。Matsubara等[10]将水解后的乳清蛋白给予小鼠口服21 d,可缓解小鼠的过敏反应,提高了小鼠的免疫能力。在膳食中添加乳清也可有着不同的功效,Buey等[11]研究表明乳清蛋白可降低由脂多糖处理后肠上皮细胞中天然免疫系统TOLL样受体和脂质过氧化的水平,这表明乳清蛋白可以有助于降低机体的炎症反应。Hellinga等[12]将乳清蛋白与人外周血单核细胞共孵育,结果表明,乳清蛋白可有助于增加对病原体的先天免疫应答。Kang等[13]的研究发现乳清蛋白可促进机体内NK细胞的活力。Nielsen等[14]对剖腹产的仔猪补充乳清蛋白,可促进仔猪肠道、免疫力和大脑的发育。

任广旭等[15]将大豆蛋白、乳清蛋白或双蛋白在大鼠运动后干预蛋白摄取,鉴定血清中19 种必需氨基酸浓度的变化,结果表明双蛋白可发挥2种蛋白的各自特性,并协同作用维持血液中氨基酸的稳定性。Liu等[16]研究发现乳清蛋白和大豆蛋白混合后给予患者食用可增加机体内氨基酸的利用率。因此,大豆-乳清蛋白两者混合食用后可协同作用于氨基酸的代谢,但是鲜有研究大豆-乳清蛋白对大鼠免疫功能的影响。实验将标准饲料、乳清蛋白饲料、大豆蛋白饲料和大豆-乳清蛋白饲料连续饲喂SD大鼠60 d,通过测评SD大鼠的血清生化指标、免疫球蛋白的质量浓度、脾淋巴细胞增殖指数、自然杀伤细胞活力、脾脏指数和胸腺指数的免疫学指标,评估膳食中添加大豆-乳清蛋白对SD大鼠免疫状况的影响,从而明确大鼠膳食中添加大豆-乳清蛋白对大鼠免疫的调节,为大鼠的膳食结构提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雌性 Sprague Dawley(SD) 大鼠(3 周龄)32只,体重 50～70 g , 购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。实验大鼠在温度为(22±1)℃、相对湿度 50%～60%、光照昼夜12 h实验环境下循环适应性饲养1周后用于实验,该动物实验遵守动物保护道德准则和黑龙江八一农垦大学动物饲养使用规则。标准饲料(AIN-93G,CP)、乳清蛋白饲料(Whey protein,WP)大豆蛋白饲料(Glycin max protein,GM)和大豆-乳清蛋白饲料(GM-WP)均委托南通特洛菲饲料科技有限公司制作。

大鼠免疫球蛋白 M(Immunoglobin M,IgM)、免疫球蛋白A(Immunoglobin A,IgA)、免疫球蛋白 G(Immunoglobin G,IgG)检测试剂盒;生化指标 17 项:尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总蛋白(TP)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙转氨酶活力(GPT)、总胆汁酸(TBA)、尿素氮(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)、肌酐(CRE)等测试盒。

小鼠淋巴瘤 YAC-1细胞、刀豆蛋白(concanavalin A , ConA)、台盼蓝、RPMI-1640 培养液、胎牛血清(fetal bovine serum , FBS)、CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测试剂盒、胰蛋白酶(比酶活力120 kU/g)。

1.2 仪器与设备

HF-90型 CO2细胞培养箱, Model 680 型酶标仪,DK-98-1 型电热恒温水浴锅,荧光分光光度计,高压灭菌锅, HVD-1320洁净工作台。

1.3 方法

1.3.1 小鼠的分组与饲料的制备

SD大鼠32只,进行1周的适应性饲养后随机分为4组,每组8只,每组大鼠按照饲喂标准饲喂不同组分的饲料,采取自由摄食的方式,实验用标准饲料是美国营养学会的 AIN-93G 大鼠纯合日粮标准饲料,WP 饲料、BSP 饲料和黑豆-乳清“双蛋白”(BS-WP)饲料等氮等能,结合蛋白粉的营养水平,参照 AIN-93G 标准,饲料详细配方及分组见表1,连续饲喂60 d。

表1 饲喂SD大鼠不同组分的饲料配方

1.3.2 血清生化指标和免疫球蛋白分析

对 SD 大鼠进行饲喂 60 d后,称量体重,麻醉后,采取腹主动脉收集血液。血液样品静置 30 min 后,于 4 000 r/min 离心 10 min,按照 16 项生化指标及 IgM/IgA/IgG 试剂盒说明书分别检测各项指标。

1.3.3 免疫器官指数的测定

各组大鼠收取血液后处死,分别取出脾脏和胸腺,使用滤纸去除剩余血液,将其置于无菌平皿中分别称重并记录,分别按照式(1)和式(2)计算脾脏和胸腺指数。

(1)

(2)

1.3.4 脾淋巴细胞增殖实验

无菌条件下将各组 SD 大鼠剖腹,取出脾脏置于盛有 Hank’s 溶液中无菌培养皿中,使用眼科镊将其剪碎。取无菌注射芯,对置于细胞筛网上的脾脏组织进行碾压研磨,将制备的脾脏匀浆使用200目的细胞筛网进行过滤,加入 2 mL 的 Hank’s 液将细胞筛网中组织吹洗掉,将收集的脾脏组织悬浮液收集于离心管内,4 000 r/min 离心 5 min ,弃去上清液。加入 2 mL Hank’s 液重悬脾细胞,再加 3 倍体积的红细胞裂解液混匀细胞,静置 3 min,4 000 r/min离心5 min, 弃去上清液。加入5 mL的RPMI-1640细胞培养液将沉淀重悬成单细胞悬液,吸取适量的细胞悬液与台盼蓝试剂混合计量细胞浓度,使活细胞比例大于95%,并调整细胞浓度为 2×105个/mL。

将调整浓度后的细胞悬液分别按照每孔 200 μL的体积接种于 96 孔细胞培养板,然后每孔加入 20 μL 的 ConA(终质量浓度为 5 μg/mL), 混匀每孔内的细胞后,将其置于 5% CO2细胞培养箱中培养24 h,再加入 21 μL 的 CCK-8 溶液,继续放置于细胞培养箱中孵育 4 h ,然后取出置于酶标仪中,测定 450 nm 波长处的光密度值。以不添加脾细胞悬液的RPMI-1640培养液作为空白孔,脾淋巴细胞增殖指数按照式(3)计算。

(3)

1.3.5 NK细胞活性分析

靶细胞制备:将稳定传代的靶细胞(YAC-1 细胞)培养至对数生长期,重悬靶细胞调整浓度为1×104个/mL。效应细胞制备:将 1.3.5 制备的脾细胞悬液调整浓度为 5×105个/mL。将靶细胞和脾细胞悬液分别吸取 50 μL/孔接种于 96 孔细胞培养板内,混匀每孔内的细胞,于细胞培养箱孵育24 h,然后每孔添加10 μL的 CCK-8 试剂,继续孵育4 h, 取出置于酶标仪中测定450 nm波长处各孔的光密度值。自然杀伤细胞活力按照式(4)计算。

(4)

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 大豆-乳清蛋白对大鼠血清生化指标的影响

由表2可知,CP、WP、GM组大鼠血清GLU、TC、TG、UA、CK-MB和AST的含量显著高于GM-WP(P<0.05) , GM-WP组大鼠血清TP、GLOB 、ALB、GPT、HDL、LDL、TBA、LDH、TBIL和CRE含量显著高于CP、WP、GM组(P<0.05), GM-WP组大鼠血清TP质量分数比CP、WP、GM组分别增长了27.24%、21.00%和30.71%, ALB质量分数分别增长了55.08%、29.56%、27.92%, GLOB质量分数分别增长了23.44%、18.33%、29.54%, GPT质量分数分别增长了116.03%、46.66%、60.80%, BUN质量分数分别增长了46.39%、17.57%、9.85%。血清生化指标不仅反映动物机体对营养物质的吸收,更能体现代谢能力,TP、ALB、GLOB、GPT、BUN在机体蛋白质代谢良好时可升高[17],程璞等[18]将含有大豆蛋白的饲料饲喂给仔猪测定生化指标,结果表明大豆蛋白促进仔猪血清TP、ALB、GLOB、GPT、BUN含量的增加,促进了仔猪机体的免疫力。TC、TG、HDL、LDL与机内的脂质代谢相关,肖聪丽等[19]对构建的高胆固醇HepG2细胞模型表明大豆蛋白可抑制细胞内的 TC、TG、HDL、LDL的表达。实验结果表明,摄食GM-WP可提高大鼠机体的免疫能力、蛋白质代谢能力和肝脏的代谢能力。

表2 饲喂不同组分饲料对SD大鼠血清生化指标的影响

2.2 大豆-乳清蛋白对大鼠血清中免疫球蛋白分泌的影响

GM-WP对大鼠Ig水平的影响如图1所示,WP、GM组Ig含量与 CP组相比,无显著性差异,相较于其他组差异显著,IgG质量分数增加24.48%、21.84%、23.72%, IgA质量分数增加了17.93%、13.13%、12.78%,IgM质量分数增加了3.61%、5.45%、6.48% ,这可以看出GM-WP可促进大鼠免疫球蛋白的分泌,提高机体的免疫能力。Zhang等[20]将分离纯化的小分子大豆蛋白治疗由环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠,结果表明大豆蛋白可改善免疫抑制的小鼠血液中免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)水平,这一结果证实了大豆蛋白是一种有效的免疫调节剂。Matsukawa等[21]将初乳乳清蛋白口服给山羊3周,研究表明,乳清蛋白可促进免疫球蛋白的分泌。虽有研究表明大豆蛋白或乳清蛋白可促进机体的免疫球蛋白的含量,但是本研究中,WP、GM和CP组无显著性差异,这可能也是由于实验中采用的是未分级的大豆蛋白[22],小分子的大豆蛋白更有利于机体的吸收和消化,乳清蛋白口服6周和12周时,与未服用的相比,乳清蛋白在口服12周显著增加了患者体内免疫球蛋白的含量,但是在第6周无变化[23]。GM-WP则可提升大鼠免疫球蛋白水平,是由于大豆与乳清蛋白可协同释放氨基酸,也就是蛋白质合成的基本单位。

注:相同字母无显著性,不同字母显著性差异(P<0.05)。

2.3 大豆-乳清蛋白对大鼠免疫器官指数的影响

图2为GM-WP对大鼠免疫器官指数的影响,由图2可知,GM-WP组显著性高于CP、WP和GM组,且WP显著高于CP和GM组(P<0.05),而CP和GM组无显著性差异,其中GM-WP组的脾脏指数和胸腺指数比CP组显著性提高67.99%和99.22%,比WP组显著性提高34.41%和30.66%,比GM组提高72.47%和76.56% .这表明WP和GM-WP均可提高大鼠免疫力,且GM-WP提高大鼠免疫力更为显著。Takeda等[24]将含有乳清蛋白的人造乳饲喂仔鼠14 d ,仔鼠的脾脏和胸腺指数均显著高于对照组,且对仔鼠的脾脏细胞进行蛋白质组学分析表明哺乳含有WP的仔鼠脾脏中肽含量相对丰度更高。富校轶等[25]将超滤后的大豆蛋白以不同剂量饲喂小鼠,但大豆蛋白对仔鼠的脾脏指数和胸腺指数无显著性差异。这也进一步解释了实验中只有WP和GM-WP提高了大鼠脾脏和胸腺指数,而GM对大鼠免疫器官无影响。武小亮等[26]将大豆分离蛋白和乳清蛋白混合后干预移植造血干细胞的小鼠,双蛋白干预的小鼠脾脏和胸腺指数增加,且能更快地重新建立小鼠的免疫功能,表明了双蛋白比单一蛋白更有利于机体免疫。

注:相同字母无显著性,不同字母显著性差异(P<0.05)。

2.4 大豆-乳清蛋白对大鼠脾淋巴细胞增殖和NK细胞活力的影响

饲喂GM-WP能显著促进大鼠脾淋巴细胞增殖和NK细胞活力,脾淋巴细胞增殖指数见图3a, GM-WP组的脾脏淋巴细胞增殖比CP组上升60.67%、比WP组上升39.71%,比GM组上升16.71%,差异显著(P<0.05),且GM显著高于WP组(P<0.05),WP组显著高于CP组。NK细胞活力结果如图3b所示, GM-WP组的NK细胞活力较于CP、WP和GM组提高了17.50%、30.56%、6.77%,差异显著(P<0.05),但CP、WP和GM组无显著性差异。Yimit等[27]通过测定食用大豆蛋白的志愿者大脑血流量和血液中的淋巴细胞,明确了大豆蛋白可促进机体内淋巴细胞数量的增加。Kiewiet 等[28]的研究表明乳清蛋白口服后通过流式细胞术检测脾脏中的淋巴细胞数量,乳清蛋白可促进脾脏中的淋巴细胞数增加。研究结果表明,WP、GM和GM-WP组均可促进脾脏淋巴细胞数量的增加。而CP、WP和GM组大鼠的NK细胞活力无显著性差异,食用乳清蛋白后的1 h以内可增强机体的单核细胞和多形核细胞的吞噬活性增强,NK细胞的活性降低,但在食用的1 h以后可增加NK细胞的活性,从而明确了食用乳清可促进机体免疫细胞的活性[29]。卢连华等[30]将低、中、高3个剂量的大豆蛋白腹腔注射大鼠,只有高剂量组显著性增加了大鼠NK细胞活性。这也解释了本实验中乳清蛋白和大豆蛋白组大鼠的NK细胞活力无显著性增加。

注:相同字母无显著性,不同字母显著性差异(P<0.05)。

3 结论

实验通过配比膳食中不同来源的蛋白,经过60 d饲喂SD大鼠,膳食中蛋白源为GM-WP时,可改善大鼠的血清生化指标,提高免疫球蛋白的分泌,提高免疫器官指数,增强脾淋巴细胞和NK细胞的活力,因此,GM-WP可提高大鼠的免疫能力。