焦亡相关标志物及PI3K /AKT 通路在内异症中的表达及相关性研究

苌雨环，吕丽丽，李 曼，王梦格，张铭娟，叶国柳

（蚌埠医学院第一附属医院妇产科，安徽 蚌埠 233004）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMS）是一种多因素妇科疾病，其特征在于子宫腔外子宫内膜腺体和基质的生长，影响近10%～15%的育龄妇女，在不孕症患者中，发病率约为40%～50%［1］。它是一种雌激素依赖性疾病，与慢性炎症过程、慢性盆腔疼痛、痛经和不孕密切相关，极大地降低了育龄女性的生活质量［2］。子宫内膜异位症与恶性肿瘤有很多相似之处，特别是它们的侵入性以及有着触发其他组织重塑，血管形成和神经支配的能力［3］。炎症是子宫内膜异位症的重要病理生理机制［4］，有研究报道炎症反应可通过促进炎性因子的释放从而增加异位子宫内膜细胞的黏附与增殖特性［5］。因此深入探究该疾病炎症方面的发病机制和治疗靶点具有重要的临床意义。

细胞焦亡（Pyroptosis）是一种伴随炎症反应的细胞程序性死亡［6］，是近年来炎症研究方面的焦点。研究发现PI3K/AKT 信号通路在细胞焦亡发生过程中发挥着关键作用，且细胞焦亡在不同的炎症性疾病中扮演着不同的角色［7，8］。基于上述研究背景，本实验将探讨细胞焦亡相关因子GSDMD，Caspase-1，NLRP3，IL-1β，IL-18 及PI3K/AKT 信号通路在炎症性疾病子宫内膜异位症中的表达及其相关性，从而进一步探究子宫内膜异位症发病机制，并为临床治疗提供具体靶点和实验依据。

1 材料与方法

1.1 临床标本收集

选取2022 年1 月～2023 年1 月在蚌埠医学院第一附属医院妇科行子宫内膜异位症卵巢囊肿剥除术患者的异位囊肿组织50 例为子宫内膜异位症组。另选取同期在该院行宫腔镜手术患者的正常内膜组织55 例作为对照组，且术中排除子宫内膜异位症患者。病例组年龄20～41 岁，平均年龄（37.6 ±5.7）岁，对照组年龄21～43 岁，平均年龄（38.3 ±7.8）岁。两组研究对象年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：（1）3 个月内未给予性激素药物治疗；（2）术中取得标本组织均经病理学检查确诊；（3）标本的收集均经患者及家属同意。排除标准：（1）心、肝、肾等严重功能障碍者及患有其他严重妇科疾病者；（2）患恶性肿瘤，精神疾病者；（3）患免疫及内分泌系统疾病者。术中所取所有组织标本均储存于-80 ℃冰箱以备研究使用。本研究符合人体实验伦理标准并已通过蚌埠医学院第一附属医院机构伦理委员会审批。

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA 提取及实时定量PCR 用TRIzol（天根，中国）试剂提取卵巢子宫内膜异位囊肿组织及对照组正常内膜组织的总RNA，经无核酸酶水洗之后，用Nanodrop ND-1000 分光光度计检测其纯度和浓度。根据逆转录和实时定量PCR 试剂盒（近岸，中国）说明书合成cDNA 模板，并进行荧光定量PCR 扩增反应。反应条件：95 ℃预热1 min，95 ℃变性20 s 和60 ℃延伸1 min。所有样品设置3 个副孔，使用2-△△CT法计算焦亡相 关因子，PI3K/AKT 信号通路在两组研究对象中mRNA 表达的相对水平。焦亡相关因子及PI3K/AKT 通路的引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物系列Tab 1 Primer series for qRT-PCR

1.2.2 蛋白质印迹法 配制RIPA 裂解缓冲液（碧云天），将50 mg 卵巢子宫内膜异位症异位囊肿组织或正常子宫内膜组织装进500 μL RIPA 裂解液的匀浆管中，进行匀浆处理，4 ℃，12 000 ×g，离心20 min。将等量的变性蛋白通过SDS-PAGE 分离后转移到PVDF 膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h。随即将PVDF 膜与一抗（多克隆抗-GSDMD；Caspase-1；NLRP3，1∶1 000 稀释）在4 ℃冰箱中孵育过夜。用TBST 洗涤3 遍，再将膜与二抗（1∶1 000 稀释）放至室温2 h。再次洗涤三遍，根据BeyoECL 试剂盒（碧云天）说明书进行曝光显影，最后结果用image J 软件量化处理。

1.3 统计学处理

采用SPSS 25.0 进行数据处理，Graphpad Prism 9 软件绘图。用非配对t检验分析了细胞焦亡相关因子与PI3K/AKT 信号通路在卵巢子宫内膜异位症异位囊肿与正常子宫内膜中的表达差异，并用Pearson 检验方法分析两者在卵巢子宫内膜异位症中相关性，P＜0.05 差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 焦亡相关因子及PI3K/AKT 信号通路在卵巢子宫内膜异位症中mRNA 水平显著升高

采用RT-qPCR 方法比较焦亡因子GSDMD、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 及信号通路PI3K/AKT 在卵巢子宫内膜异位症异位囊肿与正常内膜中的表达。结果显示，焦亡相关因子与信号通路PI3K/AKT 的表达在卵巢子宫内膜异位症中显著升高（P＜0.05）。见图1、2。

图1 焦亡相关因子在卵巢子宫内膜异位症异位囊肿与正常内膜中的mRNA 表达Fig 1 mRNA expression of pyroptosis-related factors in ectopic cysts of ovarian endometriosis versus normal endometrium

图2 信号通路PI3K/AKT 在卵巢子宫内膜异位症中与正常内膜中的mRNA 表达Fig 2 mRNA expression of the signaling pathway PI3K/AKT in ovarian endometriosis versus normal endometrium

2.2 焦亡相关因子及PI3K/AKT 信号通路在卵巢子宫内膜异位症中蛋白水平明显升高

同时提取卵巢子宫内膜异位症异位囊肿与正常内膜的蛋白，在Western Blot 实验中验证焦亡相关因子与PI3K/AKT 信号通路在两组中的蛋白表达水平。结果显示，焦亡相关因子及信号通路的蛋白表达水平在卵巢子宫内膜异位症中明显升高（P＜0.05）。见图3、4。

图3 焦亡相关因子在卵巢子宫内膜异位症异位囊肿与正常内膜中蛋白水平的表达Fig 3 Expression of pyroptosis-related factors at the protein level in ovarian endometriosis ectopic cysts versus normal endometrium

图4 信号通路PI3K/AKT 在卵巢子宫内膜异位症异位囊肿与正常内膜中蛋白水平的表达Fig 4 Expression of the signaling pathway PI3K/AKT at the protein level in ectopic cysts of ovarian endometriosis compared with normal endometrium

2.3 在卵巢子宫内膜异位症中焦亡相关因子与PI3K/AKT 的表达呈正相关

采用Pearson 相关性检验分析卵巢子宫内膜异位症中焦亡相关因子和PI3K/AKT 信号通路mRNA 表达量的相关性。结果显示焦亡相关因子与PI3K/AKT 信号通路在卵巢子宫内膜异位症中的表达水平呈正相关（P＜0.05）。见表2。

表2 卵巢子宫内膜异位症细胞焦亡相关因子与信号通路PI3K/AKT 表达水平的相关性Tab 2 Correlation between pyroptosis-related factors and expression levels of signaling pathway PI3K/AKT in ovarian endometriosis cells

3 讨论

子宫内膜异位症（EMS）是一种常见的慢性炎症性疾病，又被称为“不死癌症”。其复杂的症状给育龄女性的生理及心理均带来了极大的痛苦。然而到目前为止，还没有一种较完美的方法可以治疗EMS。现已推出的治疗方法包括：（1）药物疗法；（2）保留子宫和卵巢的保守手术干预或切除子宫和卵巢的根治性手术干预；（3）期待疗法［9］。但有研究表明无论方法如何，均有约50%的患者在5 年反复出现症状［1］。药物只能用于治疗已经有症状的患者，而手术不仅会影响卵巢卵泡的储备功能，且复发率也高达50%［10］。目前对该疾病形成的因素，最合理的解释是月经逆行假说，指含有可存活的细胞的子宫内膜异位症碎片经输卵管回流至骨盆，植入腹膜和腹部器官，并产生持续的炎症与粘连。虽然此理论是被接受的，但无法解释为什么90%的女性会出现月经逆行，但只有10% 的女性会发展为EMS［11］。因此解决子宫内膜异位症这一难题，需以生理病理为基础，充分了解子宫内膜异位症的潜在分子发病机制，寻找新的治疗靶点。

细胞焦亡是一种伴有炎症因子产生和释放的不同于细胞凋亡的一种特殊程序化细胞死亡，是近年来研究热点。细胞焦亡信号通路包含依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（cystein-containing aspartat-specific protease-1，Caspase-1）的经典途径和依赖Caspase-4/5/11 的非经典途径［12］。在经典途径中NOD 样受体蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）与接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和效应蛋白Caspase-1（pro-Caspase-1）相互作用产生NLRP3 炎症小体，在此过程中前体Caspase-1 被激活，活化的Caspase-1 不仅促进白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 前体成熟激发炎症反应，还切割消皮素D（gasdermin D，GSDMD）使其暴露具有打孔活性的N 端结构（GSDMD-N），GSDMD-N 在细胞膜上形成孔道，并释放大量的IL-1β，IL-18 等炎症物质引起炎症级联反应［13］。有研究报道，细胞焦亡的发生与经典PI3K/AKT 信号通路有关，且在不同的疾病中细胞焦亡与PI3K/AKT 信号通路发挥的作用不同［14，15］。最新一项研究表明，麦芽酚通过抑制PI3K/AKT 信号通路来阻断NLRP3 炎症小体形成，最终导致IL-1β，IL-18 等炎性因子减少从而达到抑制细胞焦亡来减轻椎间盘内炎症的作用［14］。而另一项研究指出在BV2 小胶质细胞中紫杉叶素可以上调PI3K/AKT 信号通路来抑制细胞焦亡从而减轻脊髓损伤后的神经炎症［8］。因此验证以炎症性疾病为特征的子宫内膜异位症中细胞焦亡与PI3K/AKT 信号通路的作用。

近期研究显示E3 泛素连接酶TRIM24 可负调控NLRP3/Caspase-1/IL-1β 介导的异位人子宫内膜间质细胞焦亡和迁移［16］。同时，Xu 等［17］的研究表明在原代子宫内膜基质细胞中，沉默长非编码转移相关肺腺癌转录本1（lnc-MALAT1）可改善NLRP3介导的焦亡和IL-1β 释放，从而缓解TGF-β1 介导的纤维化。一致地，本研究检测到焦亡相关因子GSDMD、Caspase-1、NLRP3、炎性因子IL-1β、IL-18 在卵巢子宫内膜异位症囊肿组织中的表达均高于在正常子宫内膜中的表达，因此可以证实细胞焦亡这一炎症反应参与子宫内膜异位症的发生与发展。在检测焦亡相关因子的同时还检测信号通路PI3K/AKT 的表达，实验结果显示PI3K/AKT 信号通路在卵巢子宫内膜异位症囊肿组织中同样较正常内膜组织高表达。PI3K/AKT 信号通路参与子宫内膜异位症的发展早在之前的研究中被证实［18，19］。Takeuchi 等［20］近年来发现原始卵泡的过度激活会引起子宫内膜异位症相关的卵巢储备减少，并且这种激活是由PI3K-PTEN-AKT-Foxo3 途径介导的。但至今还没有研究关注细胞焦亡与PI3K/AKT 信号通路在子宫内膜异位症中的关系。本研究采用Pearson 检验分析，得出结论卵巢子宫内膜异位症囊肿组织中的焦亡相关因子mRNA 的表达水平分别与信号通路PI3K、AKT mRNA 表达水平呈正相关。在前人研究基础上，结合本次研究推测细胞焦亡调控子宫内膜异位症是通过激活PI3K/AKT 信号通路来实现的。

综上所述，本研究首次在子宫内膜异位症中将细胞焦亡与PI3K/AKT 信号通路联系起来，有望进一步揭示子宫内膜异位症的分子机制并为其提供新的治疗靶点。本研究主要局限于组织学层面，因此验证还不够充分，后续还将从动物，细胞实验多维度探索细胞焦亡经典/非经典途径与PI3K/AKT信号通路在子宫内膜异位症中的具体调控机制。

作者贡献度说明：

苌雨环：课题的构思与实验，撰写文章；吕丽丽、李曼、王梦格、张铭娟：实验数据整理，分析；叶国柳：论文指导与修改，经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。