外泌体在骨改建及种植体骨结合中的作用

曾晓妹，李鹏程，符起亚，

（1.海南医学院口腔医学院，海南 海口 570216；2.海南医学院第一附属医院口腔科，海南 海口 570102）

细胞外囊泡（extracellular vesicle， EVs）是细胞释放的30～150 nm 大小的膜状囊泡，作为细胞间的通信分子而受到人们的关注。细胞可以分泌多种细胞外囊泡，根据生物发生、大小、密度和主要蛋白标记物可分为： 外泌体（exosomes，Exos）、微囊泡、凋亡小体等［1］。外泌体一般直径大小在 50～150 nm，来源于细胞的胞内体，而微囊泡直径大小在50～500 nm，甚至会达到1 μm，一般来自细胞膜［2］。而凋亡小体一般由细胞发生凋亡后产生，直径约在1～5 μm 左右。

外泌体作为细胞外囊泡的一种，直径大约为50～150 nm，能被内皮细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞 （mesenchymal stemcells，MSC） 等各种细胞分泌与摄取，且不同来源的外泌体在形态、内容物和功能等方面都具有特异性。外泌体作为分泌到循环中的小囊泡，它们可以被近端或远端的细胞内化，这些外泌体中的小分子（包括蛋白质和核酸）可以在内化时调节受体细胞的功能，从而在各种细胞和器官之间进行交流。此外，外泌体已被证明是将调节物质递送至靶细胞的理想纳米材料之一，并在该过程中起到保护的作用。在骨吸收与骨形成的动态平衡过程中，骨组织细胞包括成骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC）、成骨细胞（osteoblast）、破骨细胞（osteoclast）、骨细胞（osteocyte）等以及巨噬细胞（macrophages，Mφs）在骨组织中均发挥着重要的作用。骨细胞和细胞功能之间的相互驱动作用是维持正常骨结构的关键［2］。成骨与破骨失衡的状态是导致牙种植失败的重要原因。本研究以骨改建与骨源性外泌体为中心，对外泌体在全身骨组织改建中的不同作用进行概述，并以骨结合相关的外泌体为切入点，对外泌体参与骨结合的应用和展望作一综述。

1 外泌体在骨改建中的作用

骨改建的动态平衡是维持正常骨骼结构的前提，在维持骨稳态中发挥着重要的作用。外泌体存在于各种细胞的微环境中，在细胞间的通信中起着介导作用。最近的研究集中在外泌体介导的细胞之间的通讯在骨改建中的作用，并且在各种疾病模型中研究了外泌体的治疗效果。外泌体可以为受体细胞提供遗传信息，影响其特性和旁分泌因子，并导致组织改建。与细胞相比，外泌体具有稳定性好、无免疫原性、易转化、易获取等优点。不同骨源性细胞来源外泌体分泌特定蛋白质、小分子核糖核酸及其他生长因子，观察外泌体的内容物，并了解其介导骨改建的机制。

1.1 间充质干细胞来源的外泌体对骨改建的作用

骨髓中有一类具有自体更新能力的基质干细胞，称为骨髓间充质干细胞。它们可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，因此其可以影响骨的形成、维持和重建。许多研究者认为，MSCs 可实现自身增殖和分化，以此可用于替代受损的组织，并且通过旁分泌调节重要的微环境调节因子来改变受损组织的微环境［4］。在功能上，MSCs 调节细胞增殖、分化、凋亡和其他生物学功能，并间接对修复发挥治疗作用。

据以往的研究报道，在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号刺激下可影响成骨细胞的基因表达和功能，同时间充质干细胞来源外泌体（MSC-Exos）可以增加MAPK 通路相关蛋白的表达［5］。有相关研究证实，MSC-Exos 对转化生长因子β1（TGFβ1）、骨形态发生蛋白9 （BMP9）及生长因子的表达具有调节作用［6］，其在骨髓间充质干细胞的成骨分化中发挥着诱导作用。

外泌体中含有miRNAs，通过传递遗传信息介导细胞间的通讯。此外，在各种信号通路的基因调控网络中miRNAs 均有参与，发挥着不同的调节成骨的作用，并已被研究作为目标基因治疗的药物。有大量研究表明外泌体中的miRNAs 具有促进成骨细胞分化的作用。赖渝等［7］表明MSCs 分泌的细胞外囊泡中促进骨再生的三种成骨相关miRNAs（miR-196a、miR-27a 和miR-206）被高度上调，并且miR-196a 也被认为是成骨中最重要的调节因子之一。在MSCs分泌的外泌体中差异性表达的miRNA如miR-21、miR-4532、miR-125b-5p 和miR-338-3p 可能有助于促进成骨和血管生成。富含AT 序列的特异性结合蛋白2（SATB2）为一种特异性免疫组织化学生物标志物，其主要是由成骨细胞分化而来，已被证明对骨和软组织的肿瘤都有一定的作用［8］。有相关研究报道，MSCs 来源的外泌体肺腺癌转移相关转录子（MALAT1）可增强骨质疏松小鼠的成骨细胞活性，这一过程中miR-34c/SATB2 轴发挥着主要的介导作用［9］。除此之外，也有学者研究表明外泌体中的miRNAs 具有抑制成骨细胞分化的作用。有研究发现，miR-424-5p 在MSCs 来源的外泌体中过度表达，miR-424-5p 的过度表达减弱了成骨分化表明骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过上调miR-424-5p［10］，介导Wnt/β-连环蛋白轴，从而抑制成骨细胞分化。

MSC-Exos 可能通过促进血管生成来促进成骨。血管生成有助于成骨的进展，其中血液供应诱导成骨细胞的迁移和骨组织的矿化。由于在骨细胞成熟和活性中血管内皮细胞发挥着刺激作用，且骨再生与血管生成的关系密切。血管内皮生长因子（VEGF）是一种特异性生长因子，其主要作用于血管内皮细胞，对血管再生具有促进作用，对毛细血管的生成、血管内皮细胞的增殖和迁移具有调节作用，可进一步增强成骨细胞的活性，从而促进骨的再生。刘娜娜等［11］发现，MSC-Exos 不仅增强了成骨相关基因的表达，还增强了血管生成相关基因如VEGF、血管生成素1（ANG 1）和血管生成素2（ANG2）的表达。这表明MSC-Exos 给受体细胞提供了一些与血管生成和骨再生相关的信息，从而导致受体细胞激活血管内皮生长因子和成骨相关旁分泌因子的分泌。因此，MSC-Exos 可能部分有助于控制局部环境中的细胞生态位，并激活骨再生中包括血管内皮生长因子在内的旁分泌因子。目前的研究表明，骨髓间充质干细胞来源外泌体（BMMSC-Exos）可以加速内皮细胞和成骨细胞的增殖和迁移，进一步促进血管生成和成骨以促进骨折愈合。作为细胞间的沟通者，外泌体可以激活HIF-1α/VEGF 和BMP-2/Smad1/RUNX2 信 号 通路，这一机制在骨折愈合过程中起着重要作用。而在MSCs 的成骨过程中，长非编码核糖核酸（lncRNAs）正在成为新的调节剂［12］。

1.2 成骨细胞来源的外泌体对骨改建的作用

成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，因骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，可分泌胶原和糖蛋白，有利于骨基质的合成、分泌和矿化。骨髓间充质干细胞首先分化为骨母细胞，然后转化为成骨细胞前体，最后转化为成骨细胞，并且该过程由miRNAs、蛋白质、信号通路等调节。成骨细胞和成骨细胞之间的交流被认为是通过被称为外泌体的小的膜包裹的囊状颗粒进行的，该颗粒能够在循环途径中与周围的细胞膜融合。另外，也有研究表明成骨细胞来源的外泌体通过调节破骨细胞的活性，在骨微环境和骨代谢中起作用。

最近的研究表明，许多骨源性外泌体的miRNAs 参与了骨改建的调节［13］。在小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1 细胞）外泌体中存在43 个miRNAs 呈 高 度 表 达 ，包 括 miR-140-3p、miR-133b-3p 及miR-30d-5p，已有研究证实它们在骨组织的重塑中发挥着调节作用，同时还参与了对成骨细胞分化和功能的多种途径，如钙信号通路、Wnt、TGFβ 及胰岛素等。在成骨的分化过程中，包括 miR-135b、 miR-148a、 miR-199b、 miR-203、miR-218、miR-219、miR-299-5p、miR-302b 和let-7a共9 种miRNA，均在人骨髓间充质干细胞（HBMSC）外泌体中上调。 相比之下，五种miRNA（miR-155、 miR-181a、 miR-221、 miR-320c 和miR-885-5p）在HBMSC 外泌体样本中显著下调。这些下调的miRNAs 及其协同靶基因富含胰岛素信号通路以及磷酸肌醇3-激酶/Akt 通路和丝裂原活化蛋白激酶，在成骨细胞分化中这两条通路发挥着重要的作用。miRNAs 作为骨改建中的沟通者，其主要源于成骨细胞谱系的外泌体，其含有靶向关键破骨细胞分化因子。含有miR-503-3p 的矿化成骨细胞的外泌体对RANK 的表达具有调节作用，可用于抑制RANKL 诱导的破骨细胞分化。王璐等［14］研究发现，circ_0008542 是在张力刺激下（20%振幅/1 Hz/24 h 的Flexcell 培养），包含在MC3T3-E1 细胞来源外泌体中的新型环状RNA，Circ_0008542 通过miR-185-5p/RANK 轴逐渐上调破骨细胞分化和骨吸收。

成熟成骨细胞细胞系（矿化MC3T3-E1 细胞）的外泌体对ST2 成骨细胞前体细胞系的成骨分化具有促进作用，表现为成骨标记物、runt 相关转录因子2 （RUNX2）和碱性磷酸酶的表达上调，以及基质矿化增强［15］。Let-7 存在于矿化成骨细胞和成骨细胞前体的外泌体中，通过调节高迁移率族ATHOOK 蛋白2（HMGA2）和轴蛋白2 抗体（AXIN2）来增强成骨。另外，成骨细胞分化中β-连环蛋白作为必不可少的转录因子。当转移矿化成骨细胞来源外泌体后，可抑制AXIN1 的表达，并增强β-连环蛋白的表达，以此对成骨细胞前体的成骨分化起到促进作用。

1.3 破骨细胞来源的外泌体对骨改建的作用

破骨细胞是来源于巨大多核细胞，该细胞是单核巨噬细胞的前体细胞，主要负责在活生物体内的骨吸收。破骨细胞参与许多骨疾病的发生和发展，如骨质疏松症，风湿性关节炎等等［16］。破骨细胞中外泌体的鉴定蛋白质包括：细胞分化（CD）63，上皮细胞粘附分子（EpCAM），肿瘤易感基因（TSG）101，热休克蛋白（HSP）70，和β-肌动蛋白。韩光丽等［17］分析了破骨细胞来源外泌体的调节活性，得出结论：小鼠骨髓中破骨细胞在来自破骨细胞前体的外泌体刺激下数量增加，而来自成熟破骨细胞的相同数量的外泌体抑制破骨细胞的形成。

破骨细胞通过含miRNA 的外泌体抑制成骨细胞。骨改建是一个精细的过程，成骨细胞与破骨细胞的生理耦合必不可少。Sun 研究确定了破骨细胞介导的通过含miRNA 的外泌体抑制成骨细胞的机制。破骨细胞分泌富含miR-214 的外泌体，miR-214在破骨细胞中富集4 倍。这些外泌体可以通过ephrinA2/EphA2 分子整合到成骨细胞中。因此，miR-214 具有抑制成骨细胞活性的作用。另外，Garg 等［18］先 前 的 一 项 研 究 确 定miR-214 通 过 调 节成骨细胞中的Osterix 和激活转录因子（ATF）4，即重要的转录因子来抑制骨形成，这一研究进一步证实miR-214 促进破骨细胞的生成主要通过靶向Pten张力蛋白同源物的PI3K/Akt 这一途径。因此，所含miR-214 的外泌体有多种对骨破坏有利的作用。Lv 等［19］进行了一系列在试管内和在活生物体内鉴定破骨细胞来源的外泌体miR-214-3p 可转移至成骨细胞抑制骨形成的研究，为参与局部骨环境的稳态机制提出了一种miRNA 介导的破骨细胞-成骨细胞通讯范式。结果表明外泌体中miR-214-3p 可以作为细胞间信使来介导破骨细胞与成骨细胞之间的通讯，从而抑制成骨细胞的骨形成。也有研究表明，破骨细胞含有miR-23a-5p 的外泌体可有效抑制RUNX2 和升高Yes 相关蛋白1 （ YAP1 ）介导的金属硫蛋白1D 假基因（MT1DP）而有效地抑制成骨细胞分化［20］。另外，梁玲等［21］发现microRNA-146a在破骨细胞中富集了80 倍以上，使其成为调节分子和生物标记物的候选物。

1.4 骨细胞来源的外泌体对骨改建的作用

骨细胞是骨中最丰富的细胞，分布在一个相互连接的网络中，通过该网络，它们感知和响应系统或局部刺激以调节骨改建，通过细胞与细胞间的相互作用和可溶性介质来发挥其作用。骆瑜等［22］研究发现骨细胞分泌外泌体，然后在血液中循环，这是初次对于骨细胞来源外泌体联合循环外泌体的研究：将骨细胞减少的小鼠与正常小鼠的血浆进行比较，前者血浆循环外泌体中，共12 个miRNAs（miR-3473a、miR-3473b、miR-3473e、miR-5128、miR-6244、miR-6239、miR-5132-5p、miR-705、miR-208a-5p、miR-3104-5p、miR-1224-5p 、miR-5621-5p）表达水平呈下降趋势，究其原因可能与骨细胞来源外泌体的分泌减少或渗漏有关。来源于骨细胞的外泌体，可将生物活性分子转移至靶细胞，在骨改建中起着关键作用，特别是在破骨细胞和成骨细胞分化过程中［23］。目前的研究表明，骨细胞产生的外泌体可能在全身中循环，然后通过结合到细胞表面，从而转移其组成信号分子，包括miRNA 和pre-miRNA，随后由其他器官或组织中的受体细胞融合和内化［19］。骨细胞来源的外泌体已经被证明可以调节肌肉和骨骼的交流。孙金生等［24］证实了在肌生长抑制素治疗后骨细胞来源的miR-218 表达下调的外泌体可以掺入成骨细胞，并通过下调Wnt信号抑制成骨细胞分化；该过程可以通过外源性miR-218 的表达来逆转，表明骨细胞来源外泌体中miR-218 具有促进成骨的作用，拥有治疗骨疾病的潜力。

1.5 巨噬细胞来源的外泌体对骨改建的作用

巨噬细胞是一种细胞类型，可以根据局部细胞和分泌信号分化成一系列效应子亚型。血管生成是种植体骨结合的先决条件，可以输送氧气、营养物质、代谢物和细胞因子，因此对于骨修复和骨再生至关重要［25］。巨噬细胞在种植体骨结合过程中可以发挥免疫调节功能。所以巨噬细胞和骨细胞之间的相互作用对于骨形成和修复至关重要。外泌体可以在微小核糖核酸和蛋白质之间主动运输，同时传递信息到靶细胞，从而影响它们的行为并改变整个微环境［26］。

有学者研究了M0，M1 和M2 极化巨噬细胞来源的EVs 在骨修复中的旁分泌功能中的作用［27］。对富含M1 型巨噬细胞EVs 的miR-155 进行的功能检查表明，通过降低BMP2、骨形态发生蛋白9 和RUNX2 的表达，miR-155 模拟降低了MSC 成骨分化的过程，相反，用富含M2 型巨噬细胞EVs 的miR-378a 治疗骨髓间充质干细胞模拟了骨髓间充质干细胞骨诱导基因表达的增加。这些研究结果表明，极化的巨噬细胞来源外泌体微小核糖核酸参与体内观察到的骨再生的正或负调节，M0 和M2 型巨噬细胞 EVs 促进修复和再生，M1 型巨噬细胞EVs 抑制骨修复。

外泌体富含的miRNA 是关键的转录后调节因子。最近的一项研究表明，铜离子可以使Mφs 极化为促炎M1 表型，可通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）促进血管生成［28］。除了VEGF，Mφs 还可以分泌外泌体，可以靶向受体细胞，包括内皮细胞，并通过递送核糖核酸、蛋白质和其他成分来调节其功能。Mφs 分泌的外泌体含有miR-361-5p，它可以负性调节血管内皮生长因子A（VEGFA） mRNA 的转录［29，30］。总之，铜离子刺激MΦ 可下调外泌体中抗血管生成RNA 的表达和上调外泌体中促血管生成RNA 的表达，最终促进血管生成。来源于M1 型巨噬细胞的外泌体高度表达miR-155 并可被内皮细胞（ECs）摄取，ECs 同时靶向两条信号通路RAC1-PAK2 和Sirt1/AMPKα2-eNOS，从而抑制血管生成和心脏修复。Jeppesen 等［31］试图研究M2 型巨噬细胞来源的外泌体微小核糖核酸对骨髓间充质干细胞分化的影响，研究证明miR-5106 在M2 型巨噬细胞Exos 中高度表达，并且它可以转移到骨髓间充质干细胞中，其中它靶向盐酸诱导激酶 2（SIK2）和盐酸诱导激酶 3（SIK3）基因诱导体外和体内成骨细胞分化。另外有研究报道，另外有研究报道，巨噬细胞来源的外泌体含有miR-184，其可通过GATA2 转录调节因子（FOG-2）的负调控抑制VEGF 表达［2］。

2 外泌体在种植体骨结合中的功能

研究表明，种植体外涂层TA-SPEEK 可以促进骨髓间充质干细胞的直接成骨分化。更重要的是，Exo-TA-SPEEK 植入具有免疫调节和直接成骨特性，最终可促进活生物体内的骨结合和新骨形成。总之，藤荣林等［32］的研究表明外泌体是产生高级免疫调节和骨再生材料的有效和有力添加剂。此外，骨髓间充质干细胞来源的外泌体将纤连蛋白、I 型胶原等细胞外基质蛋白结合并束缚于生物材料及骨表面上。这一功能还允许外泌体作为仿生工具，诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨谱系。

研究发现，Circ_0008542 通过miR-185-5p/RANK 轴逐渐上调破骨细胞分化和骨吸收［33-35］。这种现象是骨结合微环境中响应种植体颈部不平衡应力的一种新的分子机制。此外，王娟等［30］发现AlkB 同源物5（ALKBH5）在外泌体中的过度表达明显挽救了circ_0008542 诱导的骨丢失。该研究提供了使用MC3T3-E1 细胞释放ALKBH5 的外泌体来增强即刻种植体抗性的方法。

血管生成对于种植体骨结合至关重要［36］。众所周知，巨噬细胞在血管生成中发挥免疫调节功能。巨噬细胞可以通过植入物释放的离子来影响外泌体的分泌，Co 离子可通过二价金属转运体1（DMT1）进入细胞，刺激活性氧产生，激活PI3K/AKT/mTORC1 和MEK/ERK 信号通路，调节缺氧诱导因子-Iα（HIF-1α）的转录，从而促进血管生成。目前的研究表明，对植入物进行适当的表面处理，2 000 μmol/L 的Co 离子浓度可以刺激巨噬细胞分泌促血管生成的外泌体，可以发挥血管生成潜力［37］。此外，外泌体也可以装载到种植体表面，以促进种植体周围的血管生成和骨结合［38］。

3 总结与展望

外泌体调节骨改建是一个复杂的过程，其受多方面多因素的影响。骨相关细胞来源的外泌体对骨细胞的活性和功能的影响可通过调节Wnt/β-catenin 信 号 通 路、成 骨 抑 制 基 因（RANKL、SOST、DKK1）及成骨分化基因（RUNX2、ALP）等机制实现。本文阐述了间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、巨噬细胞来源的外泌体对骨改建的作用，以及外泌体在种植体骨结合中的功能。希望本文有助于帮助读者理解外泌体在调节骨改建过程中的作用，以此为提高种植体骨结合成功率提供一个新的思路，如通过种植体所释放的离子来调节骨源性细胞所分泌的外泌体，有效调节巨噬细胞M2 极化以形成局部骨改建环境。

所有作者声明不存在利益冲突关系。