定量评价南方根结线虫趋性方法的建立及应用

魏钰洋, 谢 佳, 王 帅, 丁晓帆, 杨紫薇,白永霞, 姚友植, 孙然锋

(海南大学 植物保护学院，热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室，海口 570228)

根结线虫 (Meloidogynespp.) 属于植物根系内寄生线虫，可为害大多数开花植物[1]，主要靠口针刺伤寄主根部进行寄生，并诱导取食位点产生巨细胞影响植物健康。根结线虫感染后，作物可减产40%～80%，严重时甚至造成连作耕地内大片农作物绝收[2]，其种群在世界各地均有广泛分布，每年造成农作物损失超过1000 亿美元[3]。我国作为农业大国，危害生产的主要根结线虫种类为南方根结线虫Meloidogyne incongnita[4]。开发绿色防控手段以减轻根结线虫危害造成的经济损失成为当前十分重要的课题。

根结线虫从卵发育成2 龄幼虫后，利用自身有限的能量移动至寄主植物根部并完成侵染是其生活史中最重要的一环，这一过程离不开线虫体内化学物质感受器对线虫移动的指向作用。头感器作为线虫体内主要的化学感受器[5]，能够指示线虫分辨植物根系分泌物。研究表明，番茄碱、玉米素、柠檬烯等植物的特定代谢产物能够有效引导线虫定向运动，并且具有浓度依赖效应[6-7]，这表明线虫头感器受到特定分泌物刺激后，会沿低浓度区域向高浓度区域移动，最终到达植物根部进行侵染。而土壤环境中除了含有吸引线虫的物质外，也存在能够对线虫造成负面影响、抑制其生命活动或具有驱避作用的物质，这些物质一部分来自于土壤，例如无机盐硝酸钾[8]，还有一部分来自土壤中的微生物，例如苯并噻唑、2-辛酮[9-10]等，也有植物被病害侵染刺激后分泌的自我防御性的活性物质，如百里酚[7]及二氢辣椒碱[11]等。这些物质能够驱离根结线虫2 龄幼虫，表明根结线虫化学感受器能够警示其逃逸有害物质。利用其这一特性，如果提前在作物根部附近施用具有驱避活性的物质，则能够达到预防侵染、减轻病害的目的。因此，通过开发影响根结线虫趋性的特异性化合物而应用于作物根部保护是一个新的根结线虫防控策略。

为了能够有效地测试根结线虫对物质的趋性，已有许多研究方法被应用并证实。例如琼脂糖法[12]、沙土法[13]、微流控芯片法[14]及Pluronic F-127 (以下简称“PF 胶”)[15]等。其中，PF 胶是一类新型的高分子非离子表面活性剂，为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物[15]。质量浓度为23%的PF胶具有在4 ℃为液体、在室温凝结为固体凝胶的可逆特性，因易于操作且根结线虫能够在其中进行三维移动并被实时观察而在线虫行为研究领域得到广泛的应用。许多学者利用这一材料完成了根结线虫对植物寄主分泌物趋性的研究，发现由番茄等寄主中分离出的水杨酸甲酯、鼠李糖半乳糖醛酸-I 及根部呼吸作用产生的CO2等多种物质对线虫具有普遍的吸引活性[11,16]。PF 胶也被应用在对线虫引诱剂的合成化合物库筛选中，如尸胺和腐胺被证实同样能够引诱根结线虫[17]。在线虫对环境变化响应方面，研究者利用PF 胶测试得出大豆孢囊线虫2 龄幼虫在pH 值4.98～5.46 之间能大量积聚，且氯离子 浓度在171～256 mmol/L 区间内对大豆孢囊线虫2 龄幼虫的吸引效果最佳[18]。

然而，目前PF 胶对根结线虫的行为学研究主要集中在吸引活性物质定性筛选方面，利用PF 胶对根结线虫进行驱避活性定量检测的研究则仅有利用计数方法的少数报道[11]。由于计数方法繁琐耗时，不利于根结线虫趋性物质活性的快速大量评价，因此建立一种快速定量评价南方根结线虫趋性的方法十分必要。在本研究中，基于PF 胶设计了一种可检测根结线虫对物质趋性指数 (含正负趋性) 的模型，并建立了借助体式显微镜相机及ImageJ灰度值统计法对根结线虫的运动轨迹进行量化计算得到趋性指数从而判断趋性的新方法。采用已报道的对根结线虫趋性有明显作用的化合物进行模型和方法的验证，并利用该方法对40 种化合物进行了趋性测试。研究结果可为快速寻找吸引和驱避根结线虫化合物提供思路，也可为田间根结线虫生态防控、减少杀线虫剂的使用和减缓抗药性的产生奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试线虫 南方根结线虫Meloidogyne incongnita2 龄幼虫，采自本课题组日光温室内发病的番茄根系，采用Giannakou 等[19]的方法，洗去病根表面的沙土后挑取新鲜的卵囊，用质量分数为0.5%的次氯酸钠溶液进行表面消毒1 min，用无菌水冲洗3 次，在50 mm 培养皿内于黑暗条件下、25 ℃左右孵化，每天更换一次蒸馏水。以第4 天起孵化24 h 产生的2 龄幼虫为供试线虫，以保证线虫的活力。

1.1.2 化合物及试剂 10 种验证化合物：硝酸钾 (1000 μg/mL)、百里酚 (50 μg/mL)、苯并噻唑(50 μg/mL)、2-辛酮 (50 μg/mL)、二苯并呋喃(10 μg/mL)、3-甲氧基苯甲酸 (10 μg/mL)、1,5-戊二胺 (10 μg/mL)、1,4-丁二胺 (10 μg/mL)、十三烷(10 μg/mL) 和水杨酸甲酯 (1 μg/mL)，均购于北京伊诺凯科技有限公司。

40 种待测试化合物：对茴香胺、4-羟基-5,6-二甲基吡喃-2-酮、混旋樟脑磺酸、四水合酒石酸钾钠、对正丁基苯胺、苯甲酸、香芹酮、苯甲酸乙酯、2-氨基苯并咪唑、三苯基膦、1-氯-4-硝基苯、对羟基苯甲醛、4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮、苯甲腈、乙嘧酚、2-溴吡啶、吡啶、3,5-二氯-4-甲基苯胺、2,6-二氯苯硼酸、1-溴辛烷、N-乙基苄胺、2,4-二氯苯乙酮、桂皮醛、1-辛醛、α-紫罗兰酮、2,6-二氯苯胺、2,6-二氯-4-氨基苯酚、水杨羟肟酸、对羟基苯丙酸甲酯、1-四氢萘酮、邻氨基苯酚、碳酸丙烯酯、2-甲基间苯二酚、β-香茅醇、2,3-二甲氧基苯酚、噻吩-2-羧酸甲酯、4-乙基苯胺、香叶醇、亚磷酸二乙酯和间苯三酚，测试质量浓度均为10 μg/mL，均购于北京伊诺凯科技有限公司；PF 胶，购于Sigma-Aldrich；95%乙醇等溶剂为分析纯，购于西陇科学股份有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 NIKON SMZ745T 体式显微镜及配套数字相机 (尼康光学仪器有限公司)；63 mm WR63HW LED 环形灯源 (苏州德乐达电子科技有限公司)。

1.2 PF 胶胶体制备

根据Wang 等[15]的方法制备：在4 ℃条件下，将23 g PF 胶胶体粉末溶于80 mL 蒸馏水中并搅拌溶解24 h，得到质量浓度为23%的PF 胶胶体。将溶有待测化合物的药液加入蒸馏水中，同法用其搅拌溶解PF 胶胶体粉末，制得对应浓度的含有待测化合物的PF 胶胶体；溶剂对照则相应地加入与药液等量的溶剂。制得的胶体均贮存于4 ℃冰箱中备用。

1.3 模型设计、测试方法建立及根结线虫趋性测试

如图1 所示，在直径60 mm 玻璃培养皿底内放置一个内部长40 mm、宽20 mm、高5 mm 的硅胶模具，在模具中央放置硅胶隔垫将区域隔为面积相等的两个正方形区域。左侧加入1 mL 含有待测化合物的PF 胶胶体作为处理侧 (图1A)，右侧加入1 mL 含有95%乙醇等对照溶剂的PF 胶胶体作为溶剂侧 (图1B)，室温下放置。待其凝固后，撤去中央的硅胶隔垫，并刮去交界处左、右各4 mm 共8 mm 宽的胶体，在留出的空白区域内加入0.5 mL 空白PF 胶胶体作为缓冲区域。

图1 模型设计示意图Fig.1 Model design diagram

待全部胶体凝固后，将10 μL 约150 条南方根结线虫2 龄幼虫注入胶体缓冲区域的中心，保湿并置于25 ℃黑暗环境中8 h，待根结线虫在胶体内运动形成轨迹后对胶体平面处理侧和溶剂侧分别在固定倍数及参数下使用NIKON SMZ745T体式显微镜及配套数字相机拍摄图片，并用图像处理软件ImageJ 处理为黑白8 位图像，对轨迹对应的白色像素数进行处理和计算后可得出线虫轨迹在整张图片像素数中所占的百分比，按公式 (1)计算趋性指数 (chemotaxis index, CI)。

其中，A为处理侧所占百分比，B为溶剂侧所占百分比。规定左、右百分比各占50%的空白对照的趋性指数为1.00；当趋性指数在1.00 ± 0.05区间时，判定该处理对线虫趋性没有明显影响；高于1.05 时判定具有吸引活性；低于0.95 时具有驱避活性，即处理区域轨迹越稀疏、溶剂区域轨迹越密集，证明该化合物的驱避效果越好，趋性指数越低；反之吸引效果越好，趋性指数越高。

1.4 测试方法的验证及新化合物趋性测试和浓度梯度测试

对已报道的10 个化合物进行检测，测试浓度参考文献报道的测试浓度或取较低浓度，以检验测试方法的可靠性。验证可靠后，选取40 种未知趋性的化合物进行测试，并选择效果较为明显的两个化合物对茴香胺及间苯三酚进行5、10、25、50、100 和200 μg/mL 共6 个质量浓度梯度测试。每个化合物均设5 次平行，3 次重复试验。

2 结果与分析

2.1 模型及测试方法可靠性验证

按照图1 的设计，本研究顺利完成了模型设计及测试方法建立。同时，以PF 胶为载体对10种已报道在琼脂平板、沙土或PF 胶等介质中具有趋性活性的化合物进行重复验证。验证结果(表1) 显示：本方法测得的趋性结果与文献报道全部一致，从而证明了模型设计和统计方法的合理性。

表1 验证化合物对南方根结线虫的趋性活性Table 1 Validation of chemotaxis activity of compounds against M.incognita

根结线虫对于具有吸引活性的化合物如水杨酸甲酯及十三烷等响应较为灵敏，在1 μg/mL 或10 μg/mL 下均能检测出较为明显的吸引活性，其中十三烷在10 μg/mL 测试质量浓度下趋性指数达到1.53 ± 0.07 (图2)；对于具有驱避活性的化合物，则普遍需要50 μg/mL 或更高质量浓度才能较好地使根结线虫有效避开。在驱避活性测试中，可明显观察到根结线虫在处理侧的轨迹分布较为稀疏，证明驱避物质使线虫放弃进入处理侧转而进入溶剂侧活动 (图3)。

图2 10 μg/mL 十三烷处理侧与溶剂侧对比：A 为十三烷侧，B 为溶剂 (95%乙醇) 侧Fig.2 Comparison between 10 μg/mL tridecane and solvent treatment: A represents tridecane treatment,B represents solvent (95% ethanol) treatment

图3 50 μg/mL 苯并噻唑处理侧与溶剂侧对比：A 为苯并噻唑侧，B 为溶剂 (95%乙醇) 侧Fig.3 Comparison between 50 μg/mL benzothiazole and solvent treatment: A represents benzothiazole treatment,B represents solvent (95% ethanol) treatment

2.2 40 种化合物对根结线虫的趋性活性

根结线虫对40 种未测定化合物的趋性指数的测定结果如表2 所示，其中有22 种具有吸引活性，11 种具有驱避活性。在测试的40 种供试化合物中，对茴香胺表现出的吸引活性最强，趋性指数为1.53 ± 0.09 (图4)，而间苯三酚则表现出最强的驱避活性，趋性指数为0.69 ± 0.06 (图5)。

表2 测试化合物对南方根结线虫的趋性活性Table 2 Chemotaxis activity of test compounds against M.incognita

图4 10 μg/mL 对茴香胺处理侧与溶剂侧对比：A 为对茴香胺侧，B 为溶剂 (95%乙醇) 侧Fig.4 Comparison between 10 μg/mL p-anisidine and solvent treatment: A represents p-anisidine treatment,B represents solvent (95% ethanol) treatment

图5 10 μg/mL 间苯三酚处理侧与溶剂侧对比：A 为间苯三酚侧，B 为溶剂 (95%乙醇) 侧Fig.5 Comparison between 10 μg/mL phloroglucinol and solvent treatment: A represents phloroglucinol treatment,B represents solvent (95% ethanol) treatment

2.3 梯度浓度的对茴香胺及间苯三酚对根结线虫的趋性活性

采用设计方法检测南方根结线虫对对茴香胺、间苯三酚的梯度浓度响应。结果显示，对茴香胺在5 μg/mL 及10 μg/mL 时可较明显地吸引线虫，且随化合物质量浓度的提高吸引活性增强；而当其质量浓度提升至25 μg/mL 及以上时则出现驱避活性，表明这种物质在低浓度下吸引线虫，而浓度过高时反而对线虫的生理活动造成负面影响。而间苯三酚在5 μg/mL 时即表现出驱避活性，且驱避活性随着其质量浓度的提高逐渐加强，表明间苯三酚对于根结线虫负趋性的影响具有浓度依赖性 (图6；表3)。当间苯三酚质量浓度提升至50、100 和200 μg/mL 时，线虫的趋性活性变化趋于平缓，进一步提升浓度趋性指数无明显变化；所测浓度下未发现线虫有明显死亡现象。

3 讨论与结论

3.1 测试方法的建立、验证及测试情况

本研究建立并验证了一种基于PF 胶中南方线虫运动轨迹的图像分析法得出趋性指数的量化测试途径，为进一步优化新介质对根结线虫趋性的研究提供了新方法。对已报道的10 种具有趋性活性的化合物进行了验证及重复，证实了该方法在量化根结线虫趋性时的可靠性，并对40 种未检测的化合物进行了趋性检测，其中有22 种具有吸引活性，11 种具有驱避活性，对茴香胺对线虫具有最强的吸引活性，趋性指数为1.53，而间苯三酚具有最强的驱避活性，趋性指数达0.69。

3.2 吸引活性物质机制分析

在22 种吸引活性物质中，对线虫趋性指数达1.30 的苯甲酸乙酯同样能够明显吸引果蝇[20]。这与Jones 等[21]的结论相佐证，即线虫与昆虫含有一些保守的嗅觉结合蛋白基因。然而本研究中也有另一些物质的趋性活性并非在昆虫和线虫中具有一致性，如对线虫具有吸引活性的苯甲酸对杂拟谷盗并没有趋性活性[22]。而天然存在于留兰香中的香芹酮[23]虽然能够吸引线虫，但文献报道其对淡色库蚊却具有良好的驱避和熏杀活性[24]。造成这种差异的原因可能是由线虫和昆虫的部分嗅觉结合蛋白在进化过程中发生了基因分化，产生了物种特异性。

3.3 驱避活性物质机制分析

在11 种具有驱避活性的化合物中，间苯三酚等4 种酚类物质的处理侧线虫轨迹较为稀疏，这与已有文献报道的酚类物质对线虫有拮抗作用具有相似之处[7,25-26]，即酚类在低浓度下可以通过刺激线虫对其造成负面影响从而使其移动出现迟滞以达到驱避的目的。值得一提的是，间苯三酚的杀线虫活性此前曾有报道，如闫磊等及刘计权发现，间苯三酚对马铃薯腐烂茎线虫、南方根结线虫的LC50值分别为251.64 μg/mL 和840 μg/mL[27-28]。在本文中，南方根结线虫在低于200 μg/mL 的间苯三酚环境下未出现明显死亡现象，但其驱避活性呈现浓度依赖性，表明间苯三酚在低浓度下能够驱避根结线虫，而在高浓度下可以灭杀根结线虫，具有多种抗根结线虫活性。另外，我们发现许多酯类物质也表现出了明显的驱避活性。酯类物质对线虫活性的影响也多有报道，如异硫氰酸苄酯及磷酸三甲苯酯等，这些酯类物质不仅影响线虫的运动及趋向，同时还对线虫的生殖及卵囊的孵化具有较好的抑制活性，而作为芸薹属植物次生代谢产物的异硫氰酸酯类化合物用作土壤熏蒸剂也能够有效控制根结线虫的数量及活性[29-30]。

3.4 浓度梯度测试及浓度依赖效应分析

从趋性活性结果来看，具有吸引活性的已报道物质在较低浓度，如水杨酸甲酯在1 μg/mL 条件下即可吸引根结线虫，表明根结线虫幼虫在侵染阶段能够灵敏地感知到植物根部分泌的信号分子，从而快速完成定位和侵染过程。对茴香胺的浓度测试表明，低浓度下吸引根结线虫的物质在提高浓度后反而会驱避，表明线虫对引诱其运动的物质也有耐受界限。超出浓度界限后也会令其逃逸，导致引诱效果降低甚至变为驱避效果，这与其他一些物质对线虫的趋性表征结果一致[31]。此外发现，具有驱避活性的验证化合物普遍需要50 μg/mL 或更高质量浓度才能较好的驱离线虫，这可能是由于验证化合物在低浓度下未能对根结线虫的活力或行为造成足够影响，幼虫为了利用自身有限的能量尽快到达植物根部并完成侵染过程，会忍耐化合物造成的不利影响并继续向原方向运动。而间苯三酚在10 μg/mL 下度根结线虫的驱避活性优于已报道的化合物2-辛酮在50 μg/mL下的驱避活性，表明其具有开发为高效根结线虫驱避剂的潜能。在间苯三酚的浓度梯度测试中，根结线虫在物质浓度较低的情况下趋性具有浓度依赖性，即随着间苯三酚质量浓度提升驱避效果逐渐提高；但随着浓度进一步提升，100 μg/mL 的趋性指数(0.53)和200 μg/mL 的趋性指数(0.48)差别并不明显，可能是由于胶体内浓度到达一定阈值后，超出了线虫的感知水平，继续提高浓度无法对线虫造成更有效的驱离作用。

3.5 结论

本研究设计了一种检测根结线虫2 龄幼虫趋性的测试模型，并建立了将根结线虫在胶体中运动留下的轨迹量化为趋性指数，从而判断根结线虫趋性的全新方法。通过10 种已报道物质的趋性检测验证了方法的可靠性，并对40 种未测试化合物的趋性进行测试，筛选出吸引活性最强的对茴香胺和驱避活性最强的间苯三酚，研究了根结线虫对这两种化合物不同浓度的趋性关系，为下一步筛选发现活性更优的根结线虫驱避活性化合物提供了新方法，为未来杀线虫农药的减施增效与抗药性的预防提供了新思路。本研究结果仅为室内根结线虫趋性化合物筛选，所测试结果需进一步经过土壤及田间环境重复验证，最终确认化合物对根结线虫的趋性影响及实际防治效果。