螯合剂和有机酸对商陆修复镉砷污染农田的影响

张雅睿，黄益宗*，徐峰，保琼莉，魏祥东，铁柏清，张盛楠，韩廿，黄永春

（1.农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191；2.生态环境部土壤与农业农村生态环境监管技术中心，北京 100035；3.湖南农业大学资源环境学院，长沙 410128）

随着工业和农业现代化发展，农田重金属污染已成为日益突出的环境问题。截至2014 年，我国近20%的农田暴露在Cd、As、Pb、Hg、Zn 等重金属污染下，其中Cd 和As 污染程度较其他重金属更大[1]。目前人们主要采用物理、化学和生物修复技术来修复重金属污染农田。植物萃取技术属于生物修复中植物修复技术的一种，能有效去除土壤中重金属。植物萃取技术的环境生态风险较低，不会引起二次污染，是一种绿色修复技术且具有成本低、易操作等优点[2]。商陆（Phytolacca acinosaRoxb）是一种多年生粗壮的草本植物，其根系发达，生物量大，对环境适应性强。利用商陆来萃取土壤重金属的研究国内外也有报道。严明理等[3]研究发现，在Cd 含量为65 mg·kg-1的土壤中，美洲商陆植株地上部的Cd含量超过100 mg·kg-1，达到了Cd 超富集植物的标准。研究发现垂序商陆根、茎、叶中As 的转运系数均大于1[4]。由此可见，商陆对Cd和As具有较强的耐受和富集能力。

植物萃取技术因其修复速度较慢，常采用外源添加螯合剂等强化剂促进其萃取效率[5-6]。乙二胺四乙酸（EDTA）、皂素（SAP）、柠檬酸（CA）、苹果酸（MA）是四种常见且高效的植物萃取强化剂。EDTA 具有良好的活化土壤中Cd 的效果，能提高Cd 的生物活性，进而加快植物对Cd 的提取[7]。但EDTA 生态风险较大，不易被生物降解，容易引起二次污染。SAP 促进植物提取重金属的机制是在胶束增溶作用下，皂素分子上的酯基和羧基与固定态重金属进行络合，转变为更易于植物根系吸收的游离态重金属[8]。Tao 等[9]在对利用中间苍白杆菌和SAP 辅助植物修复Cd和苯并芘（B[a]P）共污染土壤的研究中，发现施用SAP 对东南景天的生长未产生影响，且2 g·L-1的SAP 溶液对Cd 和B[a]P 的提取率高于清水，SAP 提高了土壤中Cd和B[a]P 的生物可利用性，促进了东南景天对土壤中Cd 和B[a]P 的吸收和积累。CA 和MA 是两种最常用的低分子有机酸，主要通过降低植物根际土壤pH 值活化重金属，提高植物可利用性。CA 和MA 具有易被生物降解，在环境中淋湿和残存的风险较低的优点。唐棋等[10]发现1.25 mmol·kg-1的CA 促进象草植物提取Cd 的效果最佳，其地上部位Cd 萃取量最多达6.95 mg·株-1。Qin 等[11]通过15 d 的批量试验，研究了3 种常见的低分子量有机酸（CA、MA 和草酸）对Fe、Mn 和Al 氧化物的作用，以及它们对复合污染土壤中重金属元素释放的影响，研究发现有机酸驱动的Fe、Mn、Al 的溶解对结合在这些氧化物上的As、Cr、Zn、Ni、Cu、Cd的迁移起着主要的控制作用。

目前很多强化植物修复重金属污染农田的研究表明利用EDTA、SAP、CA和MA对植物萃取重金属具有显著促进效果。但目前相关研究多局限于对单一重金属污染农田的研究，且多集中在室内进行模拟试验。然而在重金属土壤修复实践中，农田土壤多为复合污染土壤。此外，在实际的田间地头中，当地的气候变化，土壤背景条件如水分、养分和微生物环境，植物根际与田间土壤的交互作用产生的根际环境等无法在实验室进行完全模拟和复制，且此类复杂因素的影响无法被量化[12]。因此植物萃取技术需要广泛地开展田间试验，才能得到更好的应用。在大田试验条件下开展螯合剂和有机酸对商陆修复Cd 和As 复合污染农田的研究还未见报道。本研究选取湖南省Cd和As 复合污染农田作为试验田，实地开展植物萃取的大田示范试验，研究EDTA、SAP、CA 和MA 强化商陆萃取土壤Cd 和As 的效果，为我国重金属污染农田修复提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用植物为商陆，品种为当地田间野生品种。商陆种子购自当地农民，种子品质均匀。强化剂EDTA、SAP、CA 和MA 均购于北京嘉友兴业生物科技有限公司。

1.2 试验设计

本试验的试验田选址在湖南省浏阳市蕉溪乡常丰村沙德组，为Cd和As复合污染农田。土壤总Cd和总As含量分别为0.93 mg·kg-1和109.63 mg·kg-1，阳离子交换量为12.36 cmol·kg-1，有机质含量为33.20 g·kg-1，pH 值为5.39。2020年4月22日开始种植一批长势一致的野生商陆苗，株行距为50 cm×50 cm。在商陆生长2 个月后（2020 年7 月4 日）开始进行试验处理。共设5 个不同处理：CK、EDTA、SAP、CA 和MA，分别代表用等量清水、EDTA、皂素、柠檬酸和苹果酸溶液对植物进行处理，每种处理4 次重复。本试验设置20个小区，每小区面积2 m2，共包括2株商陆，各小区随机排列。每个处理的一个重复在一个试验小区内进行，因此共20 个小区。基于前期实验室研究基础及预实验结果得知，EDTA、SAP、CA 和MA 均在用量为1.5 g·m-2时有较好的萃取效果，因此确定螯合剂和有机酸用量均为1.5 g·m-2，溶于500 mL水中，CK组施用等量清水。施用方式：距离商陆根部5 cm 左右环绕一圈把配好的螯合剂和有机酸溶液均匀倒入根际土壤中。为探究螯合剂和有机酸处理时间对商陆提取Cd和As的影响，处理后第30天时（2020年8月3日），对各处理的商陆果、叶、茎进行采样。处理后第60天时（2020年9月2日）收获商陆。

1.3 样品采集及指标测定

2020年8月3日在每个小区随机选取1～2株长势均匀的商陆进行茎、叶和果实采样；9月2日进行整株采样，此外采集商陆的根际土壤。根际土壤采集方式为：挖出整株商陆，在其根际范围采集8～10个点的土壤混合在一起，放入自封袋中保存。

用去离子水冲洗干净植物样品，分不同部位将植物样品装入牛皮纸袋，放入烘箱。将烘箱温度设为105 ℃，进行杀青处理30 min，再将烘箱温度设置为75 ℃进行烘干，直到植物样品恒质量。在烘干过程中进行称量以验证最终达到恒质量状态。用万能粉碎机粉碎烘干至恒质量的植物样品，装入自封袋保存。植物样品消解方法为：称取0.25 g 植物样品，加入HNO3/HClO4=4∶1（体积比）的联合消解液，放置在消解炉中消煮。用去离子水将消解后的样品进行定容，定容体积为25 mL，定容后的样品装入小白瓶保存。植物样品Cd 和As 含量的测定采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）进行测定。

将土壤样品放在阴凉通风处，进行自然风干，而后采用0.15 mm 尼龙筛进行过筛，装入自封袋保存备用。土壤样品消解方法为称取0.25 g 土壤样品，加入王水[HCl/HNO3=3∶1（体积比）]-高氯酸消解液，剩余步骤与植物样品消解方法相同。在土壤与植物样品的Cd 和As 含量测定过程中，分别采用国家土壤标准物质（GWB 07401）和植物标准物质（GBW 07603）进行质量控制。

1.4 数据处理及统计

Cd 或As积累量=各器官内Cd 或As含量×各器官的干质量（g）；

转移系数（TF）=地上部各器官Cd 或As 含量/根部Cd或As含量；

富集系数（BAF）=地上部各器官Cd 或As 含量/根际土壤中Cd或As含量；

本试验的数据统计和差异显著性分析采用SPSS 25.0 软件。差异显著性（P＜0.05）利用单因素方差分析（ANOVA）及两两比较（Duncan多重比较）方法进行检验。图表利用WPS Office 2019进行绘制。

2 结果与分析

2.1 对商陆生物量的影响

不同螯合剂和有机酸处理60 d时，商陆各器官生物量（以干质量计）的响应见表1。由表1 可知，商陆植株各部位及整株生物量均未受到EDTA、SAP、CA和MA 的显著影响（P＞0.05）。由此可知，本试验选用的螯合剂和有机酸及其施用剂量对商陆的生长没有毒害作用。此外，由表1 可得，商陆单株干质量平均为1.46 kg，种植密度为1 株·m-2，因此每公顷总平均生物量为14.60 t。

表1 商陆各器官生物量对EDTA、SAP、CA和MA的响应（g·株-1）Table 1 Responses of biomass of Phytolacca acinosa Roxb.to EDTA，SAP，CA，and MA（g·plant-1）

2.2 对商陆吸收积累和转运Cd的影响

在不同处理下，商陆各部位Cd含量见图1。如图1 所示，商陆植株Cd 含量最高的部位是叶部，Cd 含量最多达9.75 mg·kg-1。在施用螯合剂和有机酸处理30 d 后（8 月3 日），与CK 处理相比，施加EDTA、SAP、CA和MA均使得商陆地上部各器官的Cd含量显著提高（P＜0.05）。在商陆果实中，EDTA、SAP、CA 和MA处理分别显著提高Cd 含量249.1%、175.8%、90.2%和174.8%（P＜0.05）。在商陆叶中，施用EDTA、SAP、CA和MA 使Cd 含量分别比CK 处理显著增加88.0%、87.0%、28.8%和91.1%（P＜0.05）。在商陆茎中，与CK处理相比，EDTA、SAP、CA 和MA 处理Cd 含量提高幅度分别为284.0%、146.8%、147.5% 和338.1%（P＜0.05）。与CK 处理相比，商陆在经过EDTA、SAP、CA和MA 处理60 d 后（9 月2 日），果实中Cd 含量显著增幅范围是36.2%～45.7%，叶中Cd 含量分别显著增多116.4%、55.0%、81.5%和109.9%，茎Cd含量最多提高了120.1%（MA），根中Cd 含量增幅分别是79.5%、53.3%、67.2%和58.4%（P＜0.05）。SAP、CA 和MA 处理下，处理时间为60 d 均比处理时间为30 d 茎中Cd含量有显著提升（P＜0.01，P＜0.001 和P＜0.05）。与处理30 d 相比，处理后60 d 后，CA 处理使商陆地上部（包括果、叶和茎）Cd含量提高了22.3%。

图1 EDTA、SAP、CA和MA对商陆植株Cd含量的影响Figure 1 Effect of EDTA，SAP，CA，and MA on concentrations of Cd in Phytolacca acinosa Roxb.

表2 为螯合剂和有机酸处理60 d 对商陆Cd 积累量的影响。从表2 可以看出，叶部是商陆积累Cd 的主要器官。与CK 相比，EDTA、SAP、CA 和MA 分别对商陆Cd 积累量产生了不同影响。MA 处理使商陆根和茎中Cd 积累量分别显著增加了92.2%和226.9%。而EDTA 使叶中Cd 积累量显著增加了86.4%，SAP 使果中Cd 积累量显著增加了25.2%。与CK 相比，EDTA、SAP、CA 和MA 处理分别使商陆地上部Cd 积累量提高67.1%、62.8%、40.4%和106.0%，其中MA 的提高幅度最大。

表2 EDTA、SAP、CA和MA对商陆植株积累Cd的影响（µg·株-1）Table 2 Effects of EDTA，SAP，CA，and MA on accumulation of Cd in Phytolacca acinosa Roxb.（µg·plant-1）

各螯合剂和有机酸处理60 d时商陆各部位Cd富集系数见图2。与CK 处理相比，EDTA 和CA 处理分别显著提高了商陆叶的Cd富集系数53.6%和62.0%，根的Cd 富集系数28.0%和31.8%。而SAP 对商陆茎的Cd 富集系数有显著增加的效果，增幅为67.0%（P＜0.05）。

图2 EDTA、SAP、CA和MA对商陆植株富集Cd的影响Figure 2 Effects of EDTA，SAP，CA，and MA on BAF of Cd in Phytolacca acinosa Roxb.

表3 为EDTA、SAP、CA 和MA 处理60 d 时，商陆Cd 转运系数的响应。与对照组CK 相比，CA 处理对商陆茎到叶的Cd 转运系数具有显著增加效果，增幅达到76.4%，使TF茎-叶达到4.48（P＜0.05）。

表3 EDTA、SAP、CA和MA对商陆植株Cd转运系数的影响Table 3 Effects of EDTA，SAP，CA and MA on TF of Cd in Phytolacca acinosa Roxb.

2.3 对商陆吸收积累和转运As的影响

在Cd 和As 复合污染的土壤中，施用4 种螯合剂和有机酸不仅提高了商陆植株体内Cd 含量，对As 含量也产生了不同程度的影响（图3）。在EDTA、SAP、CA 和MA 处理30 d 时，与CK 处理相比，施用SAP 和MA分别显著提升商陆果As含量119.1%和136.7%（P＜0.05）。EDTA、SAP、CA 和MA 处理60 d 时，施用EDTA、SAP、CA 和MA 对商陆根中As 含量的提高效果均显著，增幅分别为40.6%、18.0%、17.0%和32.8%（P＜0.05）。EDTA和MA分别使茎中As含量显著增加28.0%和72.0%，而EDTA、CA 和MA 分别使叶中As含量显著增加30.9%、32.7%和34.5%，MA 使果中As 含量显著增加64.7%（P＜0.05）。除了果中As含量，所有处理的60 d 均比30 d 商陆茎、叶中的As 含量显著提高（P＜0.05～P＜0.001）。与施加处理30 d 相比，处理60 d 后，各处理下的商陆地上部的As 含量均有明显提升，分别是施加处理30 d 的1.9（CK）、2.8（EDTA）、2.1（SAP）、3.1倍（CA）和2.6倍（MA）。

图3 EDTA、SAP、CA和MA对商陆植株As含量的影响Figure 3 Effects of EDTA，SAP，CA，and MA on concentrations of As in Phytolacca acinosa Roxb.

螯合剂和有机酸处理60 d 后，商陆植株As 积累量的变化见表4，根和叶是商陆积累As 的主要部位，整株商陆As 积累量最高达982.48µg·株-1。4 种螯合剂和有机酸中，MA 处理对商陆各部位As积累量的提高效果最显著，与CK 处理相比，As 积累量分别增加60.8%（根）、157.9%（茎）、18.9%（叶）和18.6%（果）（P＜0.05），EDTA、SAP、CA 和MA 对地上部As积累量分别提高了18.5%、23.4%、15.8%和55.1%。

表4 EDTA、SAP、CA和MA对商陆植株积累As的影响（µg·株-1）Table 4 Effects of EDTA，SAP，CA，and MA on accumulation of As in Phytolacca acinosa Roxb.（µg·plant-1）

EDTA、SAP、CA和MA处理60 d对商陆各部位As富集系数的影响见图4。由图4可知，MA处理对提高商陆各器官的As富集系数作用均显著，相比CK 组的增幅分别为53.9%（根）、72.5%（茎）、22.4%（叶）和87.9%（果）（P＜0.05）。此外，EDTA 处理也能显著提高根和果的As富集系数，增幅分别为60.0%和81.0%（P＜0.05），其他处理无显著影响（P＞0.05）。

图4 EDTA、SAP、CA和MA对商陆植株富集As的影响Figure 4 Effects of EDTA，SAP，CA and MA on BAF of As in Phytolacca acinosa Roxb.

表5 为螯合剂和有机酸处理60 d 对商陆植株转运As 的影响。由表5 可知，在MA 处理下，商陆叶到果的As 转运系数（TF叶-果）与CK 组比显著增加了68.0%（P＜0.05）。

表5 EDTA、SAP、CA和MA对商陆植株As转运系数的影响Table 5 Effects of EDTA，SAP，CA and MA on TF of As in Phytolacca acinosa Roxb.

2.4 对根际土壤总Cd和总As含量的影响

商陆根际土壤中总Cd 和总As 含量对施用不同螯合剂和有机酸60 d 的响应见图5。由图5 可知，EDTA、SAP、CA 和MA 均能显著降低商陆根际土壤中的Cd 和As 含量。其中，SAP 处理对商陆根际土壤中总Cd 含量降低效果最显著，与CK 组相比降低了24.2%；MA处理对总As含量降低效果最显著，比对照组降低了13.0%（P＜0.05）。

图5 EDTA、SAP、CA和MA对商陆根际土壤中总Cd和As含量的影响（60 d）Figure 5 Effects of EDTA，SAP，CA and MA on the concentrations of total Cd and As in Phytolacca acinosa Roxb.rhizosphere soil

3 讨论

植物生物量是影响植物提取重金属效率的关键因素之一[13]。植物根部从土壤中吸收重金属后，通过木质部转运到地上部，而后在地上各器官富集。通过整株收获植物并进行无害化处理，即可去除土壤中的重金属。在同等条件下，生物量越大的植物，其植株体内积累的重金属量越多。因此种植高生物量的重金属富集植物能去除农田中更多重金属[14]。本研究选取了生物量较大的商陆作为萃取植物，在本试验中，成熟期商陆单株干重最高达到1.60 kg，能最大提取Cd和As的量分别达6 511.17µg·株-1和982.48µg·株-1。同时，EDTA、SAP、CA 和MA 没有对商陆生长产生抑制作用，这与韩廿等[15]的研究结果一致。由此证明本研究所选取的螯合剂和有机酸及其施用剂量不会对商陆生长产生不利影响，而且商陆在螯合剂和有机酸的强化下，能积累更多Cd和As。

土壤中重金属的生物有效性是影响植物萃取效率的另一个重要因素[16]。本研究中，施用EDTA、SAP、CA 和MA 后，商陆地上部Cd、As 含量及积累量有不同程度的提高，同时土壤中Cd、As含量有相应降低。这是因为施用螯合剂和有机酸能活化重金属，提高其生物有效性，从而使商陆根系吸收土壤中更多的Cd和As，再通过转运和转化使植物根、茎和叶富集更多的重金属。Han等[17]利用EDTA 强化龙葵提取土壤Cd 和Pb 的试验中，发现EDTA 等强化剂可显著提高龙葵对土壤Cd和Pb的吸收积累。杨树深等[18]的研究发现，施用EDTA 显著地提高了蜈蚣草体内Cd 和Pb的含量，蜈蚣草羽叶中的Cd 含量在潮土与潮褐土中分别为对照的9.16 倍和2.40 倍，Pb 含量分别为对照的33.9 倍和5.97 倍，说明EDTA 极大促进了蜈蚣草对土壤Cd 和Pb 的吸收积累，这是因为施用EDTA 后可显著地提高土壤中Cd和Pb的可交换态含量。

SAP 是一种天然表面活性剂，毒性较低，具有较短的半衰期。本研究发现施用SAP 显著地降低商陆根际土壤中的Cd 和As 含量，这可能是由于SAP 可以利用胶束增溶作用活化土壤中的Cd 和As，提高它们的溶解度，从而更易于被商陆根系所吸收[16]。Tao等[9]发现添加SAP 能使东南景天根际土壤中的Cd含量显著降低，其降幅达40.9%，原因是添加SAP 显著提高了土壤Cd 的生物有效性，从而提高了东南景天对Cd的吸收积累。CA 和MA 是植物常见的根系分泌物，本研究发现施用CA 和MA 可显著地提高商陆对土壤Cd 和As 的萃取效率，原因主要有两方面：一是施用CA 和MA 可降低土壤的pH 值，促进吸附于土壤颗粒上的Cd 和As 进入液相，转为植物根系可吸收利用的形态[19]。二是CA 和MA 可以与Cd 和As 形成稳定的配合物并将其隔离到液泡中，因此CA 和MA 是通过参与重金属的运输和胞内解毒而提高植物富集Cd和As 的能力[20]。Olaronke 等[21]发现CA 比MA 处理更有利于土壤As 的移动，这与本实验的结果不同。本试验得出MA 和EDTA 强化商陆萃取土壤Cd 和As 的效果比SAP 和CA 更好，这可能是由于施用螯合剂和有机酸后受到不同的商陆根际微生物环境的影响，且大田试验的环境条件极为复杂多变，很多因素不可控，因此导致SAP 和CA 的强化效果不稳定，因此还需要进行大量的试验来验证[16]。

本文的研究结果发现，商陆根系粗壮发达，生物量较大，其叶部积累Cd 量较多，而根、叶和茎部积累As 量较多。施用螯合剂和有机酸后可显著地提高商陆对Cd 和As 的吸收积累，降低商陆根际土壤中的Cd、As 含量，因此采用EDTA、SAP、CA 和MA 强化商陆萃取土壤Cd 和As 是一种比较有潜力的修复方式。修复成本主要包括强化剂费用和田间管理人工费。EDTA、SAP、CA 和MA 试剂的价格分别约为1.8 元·g-1，2.2 元·g-1，0.36 元·g-1和0.45 元·g-1。因此每公顷所需的EDTA、SAP、CA 和MA 试剂费用分别约为26 250、33 000、5 400 元和6 750 元。但是，螯合剂和有机酸的施用量、施用方式、对周边环境影响以及它们的长期施用效果保持等问题还需要进一步研究。

4 结论

（1）EDTA、皂素（SAP）、柠檬酸（CA）和苹果酸（MA）均可提高商陆对土壤中Cd 和As 的萃取效率，综合来看，MA 和EDTA 的强化效果比SAP 和CA 更好。MA 处理使商陆地上部Cd 和As 积累量比对照处理分别提高106.0%和55.1%，EDTA 处理使商陆地上部Cd 和As 积累量比对照处理分别提高67.1%和18.5%。

（2）EDTA、SAP、CA 和MA 均能使商陆根际土壤中总Cd 和总As 含量显著降低，SAP 处理使商陆根际土壤总Cd 含量比对照处理降低了24.2%；MA 处理使总As含量降低了13.0%。