顶空固相微萃取结合溶剂辅助风味蒸发分析无籽刺梨挥发性成分及其呈香贡献

莫皓然，黄名正,，张 群，唐维媛,2，李婷婷,2，许存宾,，刘晓柱，于志海，李 鑫

（1.贵州理工学院食品药品制造工程学院，贵州贵阳 550003；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025；3.贵州医科大学公共卫生与健康学院，教育部环境污染监测与疾病控制重点实验，贵州贵阳 550025）

无籽刺梨（Rosa sterilis），也称金刺梨，是蔷薇科蔷薇属植物，是贵州特有的刺梨资源，在贵州多地都有分布，其中在安顺地区种植较多，超过25 万亩[1-2]。无籽刺梨果含有VC[3-6]、多酚[7]、黄酮[8]、多糖[9]和超氧化物歧化酶（SOD）[10]等多种营养物质和生理活性成分，具有极高的药食两用价值。无籽刺梨与刺梨（Rosa roxburghiiTratt）两者具有非常近的亲缘关系[4,11-12]，因此营养成分相似但有所差异[3,5]，无籽刺梨的含糖量高于刺梨，其果实口感也优于刺梨，在食品行业中，无籽刺梨可作为刺梨的替代品或与刺梨果实混用[13]。

食品风味是食品重要的品质之一，无籽刺梨具有独特浓郁的香气，目前对无籽刺梨的研究聚焦在其营养成分的分析，鲜有文献对其香气进行研究，已有文献报道了无籽刺梨精油挥发性成分[13-15]，付慧晓等[15]用固相微萃取技术和气相色谱-质谱联用技术，对刺梨和无籽刺梨的香气成分进行了分析；张丹等[16-17]分别对安顺普定刺梨与无籽刺梨的营养成分及香气物质比较及贵州不同产地无籽刺梨的基本营养成分及香气物质比较进行了研究，香气成分提取方法为顶空固相微萃取（HS-SPME）；林灵等[18]对金刺梨的风味物质经过发酵处理前后的变化进行了研究，采用了顶空固相微萃取（HS-SPME）提取风味物质。现有研究主要采用顶空固相微萃取（HS-SPME）法提取无籽刺梨中挥发性成分，液液萃取（LLE）联合溶剂辅助风味蒸发（SAFE）法应用较少。

测定食品中的风味成分组成复杂，不同香气提取方法具有不同的效果，目前常用的挥发性成分提取方法有顶空固相微萃取（HS-SPME）、同时蒸馏萃取法（SDE）、液液萃取（LLE）联合溶剂辅助风味蒸发（SAFE）等。HS-SPME 是集采样、浓缩、进样为一体的处理技术[19]，且在处理过程中不会造成挥发性成分的损失和分解等优势。HS-SPME 能有效避免一些大分子的干扰，具有操作简单、样品用量少、重现性好、灵敏度高、可实现选择性吸附等优点，但对沸点较高的挥发性成分提取效果较差[20]。SDE 法操作简便，萃取效率较高，但需要使用化学溶剂，萃取温度高，对一些热敏性香气组分影响较大[21]。LLE-SAFE能有效分离复杂基质中的挥发性物质，因为分离条件一般为低温、高真空，能减少热敏性挥发性成分的损失，可以较好保留萃取物原有的自然风味[22]，此方法更加适用于水果、蔬菜等的香气成分的分析[23]。据研究发现，将HS-SPME 与LLE-SAFE 两种提取方法结合，能够较全面地剖析刺梨样品中挥发性成分的组成[24]。

本研究根据课题组在刺梨挥发性成分研究中建立的方法[25-27]，以无籽刺梨为研究对象，采用顶空固相微萃取（HS-SPME）、液液萃取联合溶剂辅助风味蒸发（LLE-SAFE）来提取挥发性成分，通过气质联用（GC-MS）进行挥发性成分的鉴定，并通过分析香气活性值（Odor Active Value，OAV），来全面分析无籽刺梨挥发性成分及其呈香贡献，为无籽刺梨的香气品质控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无籽刺梨 10 月份采于贵州安顺市，已达到商业成熟度，新鲜无霉烂变质；环己酮 色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；CH2Cl2、NaCl、无水Na2SO4分析纯，萨恩化学技术（上海）有限公司；正构烷烃（C7～C30）色谱纯，默克（北京）有限公司。

Shimadzu TQ8040NX 气质谱联用仪 岛津（中国）有限公司；PAL 自动固相微萃取装置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头 瑞士CTC 公司；TGL-16A 冷冻离心机 湖南平凡科技有限公司；GDSZ-2025 恒温水浴系统 巩义予华仪器有限公司；溶剂辅助风味蒸发装置（定制）德国Glasbläserei Bahr 公司；FF-100/110 分子涡轮泵 北京中科科仪股份有限公司；韦式蒸馏柱（定制）江苏三爱思科学仪器有限公司；HN200 型氮吹仪 海能仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 无籽刺梨汁的制备 无籽刺梨洗净、破碎后榨汁，4 ℃下4500 r/min 离心5 min，取上清液在-20 ℃下冻藏备用。

1.2.2 液液萃取联合溶剂辅助风味蒸发法 取200 mL无籽刺梨汁水浴25 ℃下解冻，加入10 μL 环己酮并移入500 mL 分液漏斗，50 mL 二氯甲烷萃取三次，待试液完全分层后再合并萃取液，加入无水硫酸钠后过滤。SAFE 按图1 方式安装[22]，500 mL 圆底烧瓶为蒸馏瓶，水浴温度为40 ℃，接收瓶和冷阱置于液氮中冷却，SAFE 蒸馏头夹层水浴温度为40 ℃。在30 min 内将150 mL 萃取液用滴液漏斗缓慢、均匀加入到蒸馏瓶中，涡轮分子泵使系统压力保持在10-4Pa。萃取液于室温解冻，加入无水硫酸钠干燥，韦式蒸馏浓缩至2 mL，氮吹至500 μL 备用[26]。

1.2.3 顶空固相微萃取法 参照文献[25]的方法，将冻藏无籽刺梨汁水浴25 ℃下解冻，20 mL 顶空瓶中称入1 g NaCl，加入8 mL 无籽刺梨汁，再加入50 μL环己酮作为内标。萃取条件为40 ℃下平衡15 min然后萃取30 min。解吸附条件为不分流模式，时间为2 min。

1.2.4 GC-MS 条件 气相条件：色谱柱：InertCap Wax 毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：40 ℃保持5 min，3 ℃/min 速度升至250 ℃，保持5 min；载气流速为1.88 mL/min；进样口温度250 ℃；分流比5:1；溶剂延迟时间3.5 min。

(2)对分好的词进行编码，根据词编码，进一步生成每个句子的编号向量，向量采用固定长度，不足的位置补0。

质谱条件：电子电离（Electron Ionization,EI）；电离能量为70 eV；离子源温度230 ℃；扫描范围m/z 29～500。

1.2.5 化合物定性及定量 定性：美国国家标准与技术研究院（NIST17）质谱库进行检索，同时使用线性保留指数（retention index，RI）对比鉴定。保留指数（RI）按以下公式计算：

式中：n 为正构烷烃碳原子数；tx为待测物质保留时间，min；tn和tn+1是分别是正构烷烃Cn、Cn+1的保留时间，min。

定量：采用内标法定量，内标环己酮。按以下公式计算待测物质量浓度：

式中：As为内标物的峰面积；Ax为待测物的峰面积；ρs是内标物的质量浓度，μg/L。

1.2.6 香气活性值计算 OAV 值按以下公式计算：

式中：ρi是挥发性成分的质量浓度，μg/L；OTi为其在水中的阈值，μg/L。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 无籽刺梨中挥发性成分的GC-MS 结果分析

总离子流图如图2 所示，两种方法共计鉴定出115 种挥发性成分，相同的物质为21 种。HS-SPME提取检测到59 种化合物，LLE-SAFE 提取检测到75 种。图3 和表1 结果显示，HS-SPME 检测到的挥发性成分以酯类（33.44%）、醛类（32.23%）及萜烯类（16.31%）为主，LLE-SAFE 以醇类（34.49%）和酸类（57.35%）为主。

表1 无籽刺梨汁中挥发性成分的定性定量结果及香气活性值（OAVs）Table 1 Quantitative results and OAVs of volatile compounds in R.sterilis juice

图2 无籽刺梨挥发性成分的总离子流图Fig.2 Total ionic chromatogram of volatiles in R.sterilis

图3 无籽刺梨汁中各类挥发性成分的数量及百分含量Fig.3 Quantities and percentage contents of various volatile components in R.sterilis

2.1.1 酯类 酯类主要具有水果香韵，如浓郁的苹果香、玫瑰花香和蜂蜜香，花香和果蔬香气物质的气味前体通常是支链和芳香族氨基酸、半胱氨酸和蛋氨酸[26-27]等。如表1 所示，两种方法共检测到酯类25 种，共同检出的酯类有5 种。采用HS-SPME 检测到15 种酯类，酯类在HS-SPME 中所有检测化合物的含量占比最高，为33.44%，含量较高的三种酯类为2-乙酸庚酯、癸酸乙酯及2-乙酸戊酯，分别为16063.68、5698.71 和4145.66 μg·L-1，这与张丹等[17]研究发现酯类化合物是无籽刺梨整体香气形成的重要组成部分的结论一致。LLE-SAFE方法检测到酯类有14 种，但占比却只有2.13%，含量最高的是乙酸苯乙酯，为44415.68 μg·L-1，占所检测酯类总含量的一半以上。内酯一般具有椰子或坚果香味特征的环状酯[28]，与我们对刺梨挥发性成分的研究类似[16-17]，在无籽刺梨中也检测到γ-己内酯（2229.07 μg·L-1）、丁内酯（2129.00 μg·L-1）、己内酯（1486.74 μg·L-1）和丙位癸内酯（1363.53 μg/L）。

2.1.2 醇类 脂肪酸的氧化和氨基酸的降解是植物中醇类的主要来源[29]。两种方法共检测到27 种醇类，共有的醇类包括2-庚醇、己醇和苯乙醇3 种。HS-SPME 检测到的6 种醇类中，（Z）-3-己烯醇含量较高，这类烯醇一般是在乙醇脱氢酶的作用下代谢生成的[30]，可贡献新鲜的青草气味和草本植物气味。此外，含量较高的还有2-壬醇和2-庚醇。LLE-SAFE法萃取出26 种醇类，占比34.49%，含量较高的分别有异戊醇、（Z）-3-己烯醇、苯乙醇和己醇，并检测到了含硫化合物3-甲硫基丙醇。两种方法对醇类物质的提取分离效率差异明显，LLE-SAFE 对醇类化合物的提取效率更佳，尤其是沸点较高的醇类。相较其他无籽刺梨的研究[14-17]，采用两种提取方法检测到更多的烯醇类物质，如2-甲基-3-丁烯-2-醇、1-戊烯-3 醇、3-戊烯-2-醇、（Z）-2-戊烯醇、3-甲基-4-戊烯-1-醇、（E）-3-己烯醇、（Z）-3-己烯醇、（E）-2-己烯醇、（Z）-3-辛烯醇，可能是由于烯醇具有相对较高的沸点所导致，LLE-SAFE 萃取更有效率。

2.1.3 醛、酮类 直链醛、酮主要来源于氨基酸代谢和脂肪酸的氧化。其中，脂肪酸广泛存在于植物界，是挥发性成分重要的生源前体之一，脂肪酸代谢主要有三种路径：α-氧化、β-氧化、脂氧合酶途径[30]。两种方法提取醛、酮类的种类和含量有较大差异，共检测到25 种醛酮类物质，共有的仅有苯甲醛和6-甲基-5-庚烯-2-酮。HS-SPME 提取到更多的醛类，而LLE-SAFE 提取到更多的酮类物质。HS-SPME 法萃取到11 种醛类和7 种酮类物质，含量最高的是2-己烯醛和2-壬酮，其浓度分别为36462.78、4754.93 μg·L-1，具有青香、果香。LLE-SAFE 法萃取到1 种醛类10 种酮类，酮类含量最高的是3-羟基-2-丁酮，其含量为152728.27 μg·L-1，占酮类总含量的77%，此化合物高度稀释后有令人愉快的甜香、奶香、脂肪香气。

2.1.4 酸类 挥发性酸主要来源是脂肪酸的氧化[30]。两种方法共检测到酸类18 种，HS-SPME 则只检测到乙酸、己酸和辛酸3 种。LLE-SAFE 中检测到18 种酸类，占比为57.35%，在所有检测的种类中最高。己酸在两种提取方法中均是含量最高的，分别为3853.72 和925047.56 μg·L-1，分别占到酸类总含量的63%和41%。LLE-SAFE 还检测到了大量的（E）-3-己烯酸、辛酸、（E）-3-辛烯酸和癸酸，这与文献[15-18]报道一致。酸类物质一般具有较高的沸点和弱挥发性[19,26]，因此，两种方法所得酸类物质的种类和含量差异较大。

2.1.5 萜烯类 萜烯类的前体是二甲基烯丙基焦磷酸和异戊二烯基焦磷酸[23]，萜烯类物质一般以糖苷形式存在，在酸或酶的水解作用下形成游离态具有挥发性的香气物质，从而够赋予其果香和花香。萜烯类化合物的香气阈值较低，即使是在较低的浓度下也对物质有较大的呈香贡献，而且有助于形成特殊的香气。两种方法共检测到萜烯类物质14 种，共有的为β-环柠檬醛和2-冰片烯。HS-SPME 检测到13 种萜类，含量较高的有3,5,11-桉叶三烯、γ-Selinene、α-沉香呋喃、β-二氢沉香呋喃。（Z）-β-罗勒烯、β-石竹烯、β-环柠檬醛等在先前对无籽刺梨及刺梨的研究中均有报道[8,10,12]。LLE-SAFE 检测到4 种萜类，分别是Intermedeol、（Z）-氧化芳樟醇、2-冰片烯和β-环柠檬醛。本研究中检测到的萜烯类化合物的种类与其他文献有所差异[16-17]，这可能与产地、提取方法及检测方法的差异相关[26]。

2.1.6 其他类 两种方法共检测到其他类物质6 种。HS-SPME 检测到4 种物质，含量最高是茶香螺烷，文献[16-17]也有报道，具有草本香和茶香。LLESAFE 中检测到大量的苯乙烯，具有甜香、汽油味的香韵。

2.2 无籽刺梨汁中挥发性成分的OAV 分析

香气的贡献大小由挥发性成分的浓度及其气味阈值决定，香气活性值（odor activity value，OAV）是评估呈香贡献的常用指标之一，当挥发性成分的浓度大于阈值，该物质才能被嗅觉感知，即当OAV≥1时[31]，该成分对样品总体气味有明显呈香贡献，称其为气味活性物质。如表1 所示，有79 种化合物的气味阈值查自文献，其余化合物因未查到其气味阈值故未计算OAV，结果显示，HS-SPME 中有32 种化合物的OAV≥1，LLE-SAFE 中有44 种，共有的化合物有9 种。LLE-SAFE 中对无籽刺梨整体香气具有较大贡献的化合物比HS-SPME 中多，LLE-SAFE 对无籽刺梨香气贡献较大的化合物主要是醇类和酸类，HS-SPME 对无籽刺梨香气贡献较大的化合物主要是酯类。

酯类化合物中，HS-SPME 中OAV≥1 的物质有13 种，较高的有乙酸乙酯（707）、丁酸乙酯（567）、己酸乙酯（414）、2-乙酸戊酯（276）、乙酸异戊酯（177）和辛酸乙酯（169）。在LLE-SAFE 中OAV≥1 的物质有10 种，己酸乙酯（1352）、乙酸异戊酯（524）、丙位癸内酯（273）和辛酸乙酯（153）的香气贡献较大。酯类物质一般具有浓郁的花香、果香，贡献了无籽刺梨突出的果香、甜香及花香气味，与对无籽刺梨及刺梨的香气轮廓研究的结果较为一致[8,17,24]。

醇类中，OAV≥1 的香气活性物质分别有3 种和14 种，赋予了无籽刺梨青味、草本味和脂肪味。其中，HS-SPME 中为2-壬醇（51）、2-庚醇（41）和（Z）-3-己烯醇（1），LLE-SAFE 中是异戊醇（3491）、己醇（196）、2-庚醇（177）、（Z）-3-己烯醇（118），苯乙醇（114）和（E）-3-己烯醇（71）。

两种方法检测到OAV≥1 的醛类共有5 种，HS-SPME 中OAV 最大的为2-己烯醛（1215），具有青味和杏仁味。此外，己醛（289）也有较高的呈香贡献。LLE-SAFE 中只有苯甲醛具有呈香贡献，OAV为4。具有香气贡献的酮类共有7 种，分别为α-紫罗酮、2-壬酮、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-羟基-2-丁酮、苯乙酮和2-己酮，赋予无籽刺梨果香、花香、甜香和草本香。

OAV≥1 的酸类共有10 种，虽然LLE-SAFE 提取到了大量的酸类物质，但酸类阈值较高，对无籽刺梨汁的特征气味贡献有限。其中，OAV 较高的是己酸（356）、辛酸（122）、庚酸（19）和癸酸（11），这些物质都具有脂肪气味和酸臭味。OAV≥1 的萜烯类共有6 种，β-环柠檬醛、（Z）-β-罗勒烯和（Z）-氧化芳樟醇具有较大的呈香贡献，赋予无籽刺梨草本香和花香。此外，2-乙基呋喃具有豆香、烤面包的焦香香气，苯乙烯也具有浓郁果香香气，两者的OAV 分别为405、321。

综上，结合OAV 分析，鉴定出对无籽刺梨整体香气具有较大贡献的化合物30 种。其中，酯类中有7 种，分别是己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、2-乙酸戊酯、丙位癸内酯和辛酸乙酯；醇类有8 种，分别是异戊醇、己醇、2-庚醇、（Z）-3-己烯醇，苯乙醇、（E）-3-己烯醇、2-壬醇和2-庚醇；醛、酮类物质有6 种，分别是2-己烯醛、己醛、α-紫罗酮、2-壬酮、3-羟基-2-丁酮、苯乙酮；酸类有4 种，分别是己酸、辛酸、庚酸和癸酸；萜烯类中只有β-环柠檬醛、（Z）-β-罗勒烯和（Z）-氧化芳樟醇3 种具有较高的呈香贡献；此外，2-乙基呋喃和苯乙烯对无籽刺梨也有香气贡献。

3 讨论

通过采用HS-SPME 法和LLE-SAFE 法提取无籽刺梨中的挥发性物质，提取方法的差异会导致无籽刺梨提取物中挥发性物质种类及含量的变化。结果表明，酯类、醇类和醛酮类是无籽刺梨中最主要的挥发性物质，这与付慧晓等[15]的研究结果相似。HSSPME 对酯类物质通常表现出较LLE-SAFE 更好的提取效果[32]，无籽刺梨中的酯类物质往往阈值较低，对无籽刺梨的呈香尤其是花果香具有显著贡献，例如无籽刺梨中OAV 较高的乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯，表明乙酯类对无籽刺梨的香气做出很大贡献，其中己酸乙酯是两种提取方式均提取到的物质，这些酯类物质赋予了其果香、甜香以及类似菠萝香的香气特征。与酯类物质不同的是，醇类多具有较高的阈值，对比发现HS-SPME 对醇类物质提取效果较差，但通过SAFE 提取鉴定出了多达20 种醇类物质，其中异戊醇OAV 高达3492，赋予无籽刺梨果香的香气特征，赵荣飞的研究也表明异戊醇是无籽刺梨中重要的一大物质[33]。醛酮类物质在无籽刺梨中的含量较刺梨而言较低，但以2-己烯醛（1215）、己醛（289）和2-庚酮（238）为代表的醛酮类物质也具有较高的OAV 值，有较大的呈香贡献，赋予了无籽刺梨青草香以及类似奶酪和肉桂的香气特征。除酯类、醇类和醛酮类外，无籽刺梨中还鉴定出了酸类、芳香族类和其他类物质，两种提取方式对这些物质的提取表现出较大差异，其中两种方式共同提取出的物质包括，乙酸、己酸、辛酸、2-冰片烯、β-环柠檬醛、茶香螺烷。本研究通过GC-MS 分析鉴定，确定了无籽刺梨中的挥发性物质组成，通过计算OAV 对挥发性物质的呈香贡献做出了分析，主要的呈香贡献物质包括异戊醇、2-己烯醛、己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己醛和己酸等，这些物质通过各自的香气特征，助力无籽刺梨风味的形成，并对无籽刺梨的香气做出重要的贡献。

4 结论

采用两种提取方法结合的方式，对无籽刺梨挥发性成分进行较为全面的分析，共鉴定出115 种物质，HS-SPME 方法检测到59 种，LLE-SAFE 方法检测到75 种，其中酯类25 种，醇类27 种，醛类11 种，酮类14 种，酸类18 种，萜烯类14 种，其他类6 种；两种提取方法因对不同沸点物质的提取效率不同，所得挥发性成分的种类及含量有明显差异，共同检测到化合物只有21 种，HS-SPME 提取分离到更多种类的酯类、醛类和萜烯类物质，而LLE-SAFE 提取到更多的醇类、酸类和酮类。通过OAV 分析，共计有30 种化合物对无籽刺梨的香气有主要贡献作用，但这些物质的呈香贡献还需进一步的精准定量并使用分子感官科学相关技术来开展深入的研究。