高气压光电离飞行时间质谱用于食用油掺假的快速定性定量鉴别

傅纤雯, 金铭浩, 花 磊, 李海洋, 许光治,倪勤学, 高前欣, 张有做,3, 王 艳

(浙江农林大学食品与健康学院1,杭州 311300) (中国科学院分离分析化学重点实验室;中国科学院大连化学物理研究所2,大连 116023) (浙江骄栀科技有限公司3,杭州 311300)

食用油作为餐桌上不可或缺的重要一环,其质量安全直接关系每个人的身体健康,然而以次充好、掺假掺伪是国际国内食用油市场普遍存在的现象[1-4]。特级初榨橄榄油(EVOO)以其独特的风味品质和营养价值风靡全球,价格高昂,是易被掺假的油品;其中,以低价植物油如玉米油、菜籽油、花生油按一定比例掺入最为常见[5-7]。EVOO掺假不仅损害了消费者权益,而且可能因为过敏等原因对人体健康产生严重威胁[8]。食用油的掺假检测,尤其是EVOO的掺假鉴别是食品安全研究领域的重要课题之一[9-11]。

食用油中的挥发性有机物(VOCs)通常来源于油脂萃取过程,受生产操作条件、油料种子类别、成熟度及地理来源等的影响,VOCs种类(如烃类、醛类、醇类、酯类、酮类、吡嗪类、吡啶类、呋喃类和噻吩类等)和含量千差万别,这为食用油的种类区分和掺假鉴别提供了丰富信息[12-15]。Mansur等[16]比较了采用甘油三酯、脂肪酸、VOCs作为标志物来鉴别纯品芝麻油和被玉米或者大豆油掺假后的芝麻油。结果表明VOCs比甘油三酯和脂肪酸更有优势,可以成功鉴别出掺假量在5%的芝麻油样品。因此,对食用油VOCs的高灵敏定性定量分析是进行种类区分和掺假鉴别的有效手段。以顶空固相微萃取气质联用(HS-SPME-GCMS)等为主的色谱检测虽然定性和定量分析能力强,但需繁琐的样本处理、耗时费力,无法满足市场中海量样品高通量检测的需求[17]。因此,急需发展其他高灵敏快速检测方法以满足大宗样品的快速筛查。

基于食用油VOCs进行掺假识别的方法主要有传感器原理的电子鼻(E-nose)[18,19],气相离子迁移谱(IMS)[20,21]以及直接质谱技术等(如质子转移电离质谱PTR-MS[22,23]、选择离子流动管质谱SIFT-MS[24,25])。每种方法各有优势和不足,其中直接质谱技术可实现准确的定性定量分析、是1种非常有潜力的快检技术。Ozcan[25]利用 SIFT-MS获得了EVOO、玉米油、葵花籽油和其他种类橄榄油的VOCs指纹图谱,然后结合化学计量学,成功实现了对掺有其他油品的EVOO的鉴别;虽然该方法的谱图采集耗时较短(1～2 min),但顶空气体的获得往往需要30 min的平衡时间。因此,仍需发展更多基于不同原理的直接质谱技术及相应的分析方法用于油脂掺假的快速定性定量鉴别。

高气压光电离飞行时间质谱(HPPI-TOFMS)是1种基于真空紫外光(VUV)的阈值光电离质谱技术,具有分子离子产率高、谱图易解析,分析速度快等优点,主要用于痕量VOCs的高灵敏、在线实时分析[26-28]。本研究利用HPPI-TOFMS,结合动态顶空采样,建立了食用油中VOCs的快速检测方法;分析了4个不同种类食用油(特级初榨橄榄油,EVOO;精炼菜籽油,r-RO;花生油,PO;芳香菜籽油,f-RO)的VOCs指纹图谱。随后,以EVOO的掺假鉴别为例,利用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的S-plot 曲线,获得每种油品的特征VOCs。基于特征VOCs,实现盲样的定性鉴别,然后对EVOO中分别掺入r-RO, PO,和f-RO的二元掺假混合物进行HPPI-TOFMS分析,构建掺假浓度和特征VOCs信号强度之间的线性方程,继而利用这些方程,实现盲样掺假浓度的定量预测。研究为EVOO的定性定量掺假鉴别提供了可靠方法,也为其他种类植物油的掺假判别提供了方法学参考和技术支持。

1 实验与方法

1.1 仪器与方法

HPPI-TOFMS仪器由中国科学院大连化学物理研究所快速分离与检测课题组自行研制[26]。图1为HPPI-TOFMS与动态顶空采样系统相结合的结构示意图。

图1 动态顶空采样系统与 HPPI-TOFMS 集成的结构示意图

HPPI-TOFMS系统由HPPI电离源,离子传输系统及反射式飞行时间质谱仪3个部分组成。动态顶空采样系统由载气、加热腔体、20 mL的棕色玻璃采样瓶及其配套的PEEK针尖采样器组成。PEEK采样器通过采样瓶盖上的硅胶软垫刺入采样瓶中。针尖采样器上设有2个气体通道,一路用于载气的引入,另一路用于将食用油顶空气体导入HPPI-TOFMS的不锈钢金属毛细管中,实现采样。在整个实验过程中加热腔体保持120 ℃,且玻璃采样瓶完全浸没其中。具体操作流程如下:首先取0.7 mL的食用油样品于采样瓶中,然后盖紧瓶盖,将其置于加热腔体中,密闭孵育0.5 min后,刺入PEEK采样器,与此同时,60 mL/min的载气(高纯N2,99.999%)被引入食用油样品的顶空,载带食用油的VOCs组分经采样器上的另一通路流出采样瓶,于顶空采样瓶出口处设置有1个三通连接器,一端通过长度为30 cm/内径为250 μm的金属毛细管直接通入HPPI-TOFMS电离源内部,另一端注入尾气吸收处理系统。不锈钢金属毛细管及三通连接器由加热带及温度控制系统加热至120 ℃并保温,避免因温度下降造成的食用油VOCs冷凝。与PEEK采样器刺入采样瓶同时进行的2个操作是:1)60 mL/min的高纯N2引入采样瓶;2)质谱仪的数据采集软件开始工作。数据采集完毕后,获得采样时间为1 min的HPPI-TOFMS 质谱图,即获得不同种类食用油的VOCs指纹图谱。因此,采用高气压光电离质谱仪结合动态顶空采样,无需任何前处理,从取样到完成检测耗时1.5 min,有利于实现样品的高通量检测。

1.2 材料与试剂

特级初榨橄榄油EVOO(12种);精炼菜籽油r-RO(7种);花生油PO(17种);芳香菜籽油f-RO(6种)。所有42种纯品油均为市售。2-甲基吡嗪,2, 5-二甲基吡嗪以及二甲基二硫均为98%分析纯。

1.3 二元掺假样品的配制

EVOO掺假实验分为两部分。第一部分是建立定量回归方程:首先随机选择r-RO、PO、f-RO和EVOO各2个品牌的食用油,分别制备r-RO—EVOO(A-D)、PO—EVOO(E-H)和f-RO—EVOO(I-L)的二元掺假混合物,共生产12个系列的掺假样品(A-L)。每个系列掺假样品由12种不同掺假比例的二元混合物组成,其中 r-RO、PO 或 f-RO 的体积分数从1%增加到50%(1%、3%、6%、9%、15%、22%、25%、32%、35%、37%、40%、50%)。利用这些掺假样品构建线性回归方程,横坐标为掺假浓度,纵坐标为r-RO、PO 或 f-RO的特征VOCs在HPPI-MS谱图中的信号强度。第二部分是利用第一部分建立的线性回归方程对3个盲样的掺假浓度进行定量计算,计算出的掺假浓度也称为预测掺假浓度,其与实际掺假浓度之间的绝对差值称为预测偏差。盲样是通过随机选择不同品牌的r-RO、PO、f-RO和EVOO各1种(排除第一部分掺假实验中选择的样品),分别配制成盲样1:r-RO—EVOO,盲样2:PO-EVOO和盲样3:f-RO-EVOO,其中r-RO、PO 或 f-RO的体积分数依次为5%、7%、12%、17%、19%、27%、30%、42%、45%。

1.4 OPLS-DA和S-plot曲线

OPLS-DA作为一种新型、有监督的判别分析统计方法,通常用于建立样品类别之间的关系模型;S-plot曲线是OPLS-DA方法提供的用于挖掘造成两类样品之间差异的关键物质。OPLS-DA于2002年提出,在化学计量学相关的应用中日益广泛,如农产品、食品质量安全控制相关的产地溯源、快速分类判别和预测等[29-31]。研究采用SIMCA 14.1软件(Umetrics, Sweden)构建OPLS-DA模型和S-plot曲线。

2 结果与讨论

2.1 动态顶空采样方法优化

对可能影响HPPI-TOFMS检测灵敏度的动态顶空采样相关的4个实验条件:采样温度、载气流速、孵育时间和食用油用量进行了优化。不同因素对HPPI-TOFMS谱图的影响见图2。由图2a所示,随加热温度从60 ℃升到120 ℃,质谱图中出现了更多的信号峰,且信号强度增加较多,这是由于高温促进了液体内部VOCs的释放。然而,当温度从120 ℃升到140 ℃时,谱图基本没变化,猜测120 ℃可以产生足够的挥发性化合物,保证检测时足够的灵敏度。由图2b所示,随载气流速从60 mL/min升到250 mL/min,质谱峰的个数几乎没有发生变化,但60 mL/min时,样品的信号强度可以达到最高。猜测这是由于质谱进样毛细管的流速是50 mL/min,更高的载气流速会稀释样品顶空气体,不可避免造成信号强度的下降。由图2c所示,随着孵育时间从0 min提高到2 min,整个谱图信号强度差异不大,质谱峰的个数也基本类似。猜测在120 ℃的温度下,样品顶空气体会很快达到平衡,无需长时间的平衡。为了保持样本分析前状态的一致性,最终决定采用0.5 min的孵育时间。由图2d所示,随样品用量从0.1 mL提高到0.4 mL时,大部分质谱峰的信号强度增加迅速;从0.4提高到0.7 mL时,大部分质谱信号峰的强度轻微增加;从0.7 mL提高到1.5 mL时,谱图几乎没有变化,猜测可能是顶空气体中的VOCs浓度达到了饱和。因此,采用0.7 mL样品用量,检测结果最优。动态顶空采样的最优条件确定为:120 ℃的加热温度,60 mL/min的采样流速,0.5 min的孵育时间,以及0.7 mL的食用油用量。

图2 采样温度、载气流速、孵育时间、样品用量对HPPI-TOFMS谱图的影响

2.2 不同种类植物油的特征VOCs定性判别

研究共获得42种纯品植物油(12种EVOO, 7种r-RO, 17种PO, 和6种f-RO)的HPPI-TOFMS谱图,见图3。结果显示:同一种类植物油的VOCs指纹图谱类似。通过比较这42种植物油的HPPI-TOFMS谱图,发现用于区分不同种类植物油的质量峰几乎一致,并不依赖于食用油品牌的差异。不同种类植物油的HPPI-TOFMS谱图(EVOO、r-RO、PO、f-RO)如图3所示,谱图中对可能成为区分不同种类植物油的关键质量峰都进行了标注。从质量峰和信号强度的角度,可以看出这4种植物油存在显著区别,这也表明HPPI-TOFMS可以快速高灵敏地捕捉到不同种类食用油的VOCs指纹图谱。

图3 不同种类植物油的HPPI-TOFMS谱图

随后,为了找到EVOO与r-RO、PO及f-RO相区别的关键VOCs,采用OPLS-DA对HPPI-TOFMS获得的谱图进行建模,并用S-plot曲线找寻差异性质量峰,见图4。

图4 EVOO分别与r-RO、PO、f-RO的OPLS-DA图及S-plot曲线

从图4可知,r-RO与EVOO相区别的特征质量峰有2个,m/z=66和m/z=108;PO与EVOO相区别的特征质量峰4个,分别是m/z=109,m/z=81,m/z=95,m/z=67;f-RO与EVOO相区别的特征质量峰有2个,m/z=94和m/z=81。这些特征质量峰在图3,每种植物油的HPPI-TOFMS谱图中均有标注。因此,当待检测的EVOO盲样谱图中出现m/z=66和m/z=108的特征峰时,可定性判断该盲样含有r-RO;同理,可定性判断盲样中是否含有PO或者f-RO。随后,通过对这些质量峰进行HPPI-TOFMS精确质量校正,购买标准物质验证,采用顶空固相微萃取(HS-SPME)GC-MS验证,与文献比对等方法,综合确认出这些特征质量峰的物质归属[32-36]。在r-RO中,m/z=66和m/z=108分别是1,4-双(亚甲基)环己烷的2个离子峰,分别对应[M-CH3]+的碎片峰以及[M]+的分子离子峰。在PO中,m/z=109和m/z=81是2,5-二甲基吡嗪的2个特征峰,分别对应[M+H]+和[M+H-2N]+;同理,m/z=95和m/z=67是2-甲基吡嗪的2个特征峰,分别对应[M+H]+和[M+H-2N]+。在f-RO中,m/z=94是二甲基二硫的[M]+分子离子峰;m/z=81是甲基烯丙基氰化物的[M]+分子离子峰,通过与图3d中f-RO的HPPI-TOFMS谱图比对,显然m/z=81的信号强度远低于m/z=94,因此对于f-RO,可以只选用高信号强度的二甲基二硫作为特征VOC标志物。

HPPI-TOFMS质谱图结合OPLS-DA,筛选得到:r-RO的特征性VOC为1,4-双(亚甲基)环己烷,对应质量峰m/z=66和108;PO的特征性VOC为2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪,对应质量峰m/z=109,81,95和67;f-RO的特征性VOC为二甲基二硫,对应质量峰m/z=94。这些特征VOCs可用于未知EVOO盲样的定性鉴别。

2.3 基于特征VOCs—定量判别EVOO二元混合物的掺假比例

基于2.2节筛选出的每种植物油的特征VOCs,构建其不同质量峰的信号强度之和与掺假浓度的线性关系,实现未知盲样掺假浓度的定量判别。对r-RO—EVOO二元掺假混合物(A-D,4个掺假系列),利用r-RO的特征质量峰m/z=66+108的信号强度之和与掺假浓度(1%～50%)构建了4条线性曲线,分别是曲线A:Y=223.18+31.43X(r2=0.993 4),曲线B:Y=231.10+17.72X(r2=0.995 4),曲线C:Y=162.69+30.22X(r2=0.997 9)和曲线D:Y=262.89+11.35X(r2=0.993 0)。同理对PO—EVOO二元掺假混合物(E-H,4个掺假系列),横坐标为掺假浓度,纵坐标为PO中4个特征质量峰(m/z=109+81+95+67)的信号强度之和,E-H的4条线性方程分别为:Y=1 289.18+354.11X(r2=0.992 8),Y=870.94+247.40X(r2=0.996 1),Y=1 166.01+319.31X(r2=0.994 2),Y=836.85+295.26X(r2=0.996 1)。对f-RO—EVOO二元掺假混合物(I-L,4个掺假系列)对应的I-L的4条线性方程分别为:Y=559.16+601.42X(r2=0.997 7),Y=305.51+522.76X(r2=0.994 2),Y=562.01+543.13X(r2=0.994 9)以及Y=514.15+301.91X(r2=0.990 5)。

分别采用线性方程对盲样的掺假浓度进行预测。对r-RO—EVOO二元掺假混合物,分别采用A-D的4条线性曲线对其掺假浓度进行计算,所得结果命名为“预测的掺假浓度”,那么“预测的掺假浓度”与“真实的掺假浓度”之间的差值为“预测偏差”,用绝对值表示。每个掺假浓度有3个平行样品,因此结果用“平均预测偏差绝对值”表示。r-RO—EVOO盲样的掺假浓度预测情况表见表1,考虑到不同掺假浓度的偏差,最终结果采用“总-平均预测偏差绝对值的平均值”来表示,对r-RO—EVOO盲样,该值为2.87%。

表1 r-RO—EVOO盲样的掺假浓度预测情况表

同理,对PO—EVOO二元掺假混合物,分别采用E-H的4条线性曲线对其掺假浓度进行计算,PO—EVOO盲样的掺假浓度预测情况表见表2,总-平均预测偏差绝对值的平均值为1.26%。对f-RO—EVOO二元掺假混合物,分别采用I-L的4条线性曲线对其掺假浓度进行计算,f-RO—EVOO盲样的掺假浓度预测情况表见表3,总-平均预测偏差绝对值的平均值为1.58%。

表2 PO—EVOO盲样的掺假浓度预测情况表

表3 f-RO—EVOO盲样的掺假浓度预测情况表

3种盲样的“总-平均预测偏差绝对值的平均值”分别为2.87%,1.26%和1.58%,均位于3%以内,较小的预测偏差体现了该定量策略的可行性,也进一步体现出HPPI-TOFMS检测的可靠性和稳健性。

3 结论

研究采用HPPI-TOFMS,结合动态顶空采样,建立了食用油中VOCs的高灵敏快速检测方法,操作简单,环境友好,无需任何前处理,仅1.5 min即可获得不通过种类食用油的指纹图谱。每种油品在HPPI-TOFMS谱图中有代表自己的独特VOCs,如1, 4-双(亚甲基)环己烷和二甲基二硫分别是r-RO和f-RO的标志性VOC; 2, 5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪是PO的标志性VOC。根据这些标志VOCs,可实现盲样中r-RO、f-RO以及PO的定性判别。预测掺假浓度和实际掺假浓度之间良好的一致性,体现了该分析方法的可靠性和准确性。研究有望实现海量市场样品的高通量快速筛查,为其他种类植物油的掺假判别提供了理论基础和技术路线,该方法可应用于其他基于VOCs分析(如油脂氧化变质的快速判别)进行的食品安全、感官品质等方面的研究课题和领域。