广谱抗菌活性瑞士乳杆菌AJT 在发酵乳中的应用

张恩馨，刘娜，刘玮，梁程媛，塔娜，乌云达来

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018;2.赤峰市农牧局，内蒙古 赤峰 150400）

0 引 言

随着生活水平的快速发展，发酵乳逐渐变成了人们的刚需[1]。发酵乳在发酵过程中可将牛奶中的乳糖分解为半乳糖和葡萄糖[2]，缓解乳糖不耐症[3]，同时可将蛋白质分解为细微的蛋白质颗粒，还可以降解酪蛋白，使得发酵乳比一般乳中的必需氨基酸和肽更丰富[4-5]，还可以降低胆固醇浓度[6-7]，对人体健康有益[8]。目前市场上的发酵乳存在着质量安全问题引起了政府、媒体和消费者的高度关注[9]，发酵乳产品由于货架期较短使得发酵乳在长时间跨区域销售受到了一定的限制[10]，消费者对发酵乳质量的期望值不断下降[11]。而发酵乳在生产过程中，影响发酵乳保质期的因素有很多，如生产原料的微生物含量、生产过程中的卫生条件、发酵乳后酸化过程、包装材料的卫生等[12]。发酵乳的质量安全问题源于其保质期短，冷链运输成本高及品质安全，所以延长发酵乳的保质期就尤为关键。

瑞士乳杆菌（L.helveticus）为乳酸杆菌属中常见的益生菌[13-15]，是发酵乳制品的发酵剂[16]。L.helveticus 能赋予产品优良的感官性质，且能产生一些生物活性肽，如ACE 抑制肽和细菌素[17-18]，其产生的具有抑菌或杀菌作用的物质在食品防腐、保鲜和延长货架期等方面起重要作用[19-21]。L.helveticus AJT 筛选自内蒙古传统发酵乳制品，具有广谱抗菌活性，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌均有抑制作用，尤其对真菌的抑制作用更为突出[22]。因此，将L.helveticus AJT 用于发酵乳制备中，探究其对发酵乳保质期的延长效果。

1 材料与方法

1.1 菌株与主要试剂

广谱抗菌活性L.helveticus AJT 分离自内蒙古地区传统乳制品；S.thermophilus ST962 和L.bulgaricus LB1823均为本实验室保藏菌株。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵乳的制备工艺

全脂奶粉→加蔗糖→水化（45 ℃，30 min）→预热（65 ℃）→均质→杀菌（95 ℃，加热5 min）→迅速冷却到（45 ℃）→接种（接种时要求按无菌操作进行，避免污染）→发酵→迅速冷却→放在冰箱中4 ℃后熟

实验组以L.helveticus AJT 与S.thermophilus ST962作为发酵剂；对照组以S.thermophilus ST962 和L.bulgaricus LB1823 作为发酵剂。

1.2.2 发酵乳正交实验设计

对发酵乳制备具有主要影响的4 种因素（菌株AJT 和菌株ST962 配比（A），接种量（B），培养温度（C），蔗糖浓度（D））作为自变量，利用SPSS 软件设计正交设实验,如表1 所示，以感官评分作为响应值，对发酵乳发酵条件进行优化。

表1 正交试验因素水平设计

1.2.3 发酵乳感官评分标准

以RHB-2020《发酵乳感官评鉴细则》为参照[23]，并修订制作发酵乳感官评分表进行评定，如表2 所示。

表2 发酵乳感官评分

1.2.4 滴定酸度的测定

以GB 5009.239-2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》测定发酵乳的滴定酸度[24]。

1.2.5 验证实验

根据正交实验结果选择4 组发酵条件进行验证实验。

1.2.6 乳酸菌活菌数计数

以GB 4789.35-2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》测定发酵乳活菌数[25]。

1.2.7 大肠菌群、霉菌、金黄色葡萄球菌的检测

大肠菌群的计数根据GB 4789.3-2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》进行[26]；霉菌的计数根据GB 4789.15-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行[27]；金黄色葡萄球菌的检测根据GB 4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》进行[28]。

1.2.8 黏度的测定

将样品从冰箱中取出放置使其达到室温后，取100 mL 发酵乳用SNB-2 型数字黏度计进行测量，采用3 号转子，保持扭矩在10%～90%内有效，每个样品重复测量3 次，计算平均值[28]。

1.2.9 发酵乳保质期的研究

将实验组与对照组分别放置于4 ℃和室温（20 ℃）条件下，每隔7 d 分别取样，测定发酵乳中滴定酸度、乳酸菌活菌数、霉菌、大肠菌群、金黄色葡萄球菌的指标。

1.2.10 室温暴露试验

将实验组与对照组于室温（20 ℃）条件下敞口放置，每隔一日取样（共7 d）检测霉菌，每个样品做3 组平行样。霉菌计数方法同1.2.7。

1.2.11 数据分析

用Excel 处理实验数据，用SPSS 19.0 软件进行方差分析。

2 结果与讨论

2.1 发酵乳制备条件正交实验优化

从发酵条件正交实验优化结果可知，如表3 所示，凝乳时间在3.0～5.0 h 之间，符合工业化发酵要求。经方差分析确定，影响发酵乳感官评分的因素主次顺序为D＞A＞C＞B，即蔗糖含量＞菌种配比＞培养温度＞接种量。确定发酵乳最优发酵条件组合为A2B2C3D1，即菌种比例为1∶3、接种量为4%（体积比）、培养温度为42 ℃、蔗糖浓度为6.0 g/mL。

表3 L9(34)正交试验设计及结果

2.2 验证试验

发酵乳发酵条件验证实验如表4 所示，与正交实验结果一致，发酵乳滋味纯正、香气浓郁、凝乳质地光滑、无不良发酵气味。

表4 试验结果比较

表5 发酵乳中微生物变化

2.3 发酵乳酸度的变化

在4 ℃贮藏期实验组的滴定酸度如图1（a）低于对照组，尤其在冷藏至35 d 时对照组滴定酸度已经超过120.0 °T，而实验组的滴定酸度较适宜（<110.0 °T）。在常温（20 ℃）贮藏至第21 天时实验组的滴定酸度如图1（b）为120.2 °T，而对照组的滴定酸度为142.8 °T，且有令人不愉快的气味。因此，菌株AJT 对发酵乳的后酸化起到抑制作用。

图1 发酵乳酸度的变化

2.4 发酵乳乳酸菌数的变化

在4 ℃贮藏期实验组与对照组的乳酸菌总数如图2（a）所示差距不大，而到后期由于菌株AJT 抑制发酵乳后酸化作用，实验组乳酸菌数高于对照组。在常温（20 ℃）贮藏期，对照组乳酸菌数高于实验组，贮藏至第35 天时实验组乳酸菌数如图2（b） 为2.39×106CFU/mL，对照组乳酸菌数为1.2×106CFU/mL，此时两种发酵乳酸度已超150 °T，虽实验组乳酸菌数高于对照组，但实验组的酸度低于对照组。因此，菌株AJT 能显著抑制发酵乳的后酸化作用，该结果与发酵乳酸度的变化结果一致。

图2 发酵乳乳酸菌数的变化

2.5 发酵乳的微生物变化

在4 ℃贮藏期实验组符合GB 19302-2010《食品安全国家标准 发酵乳》的要求[29]，未检出霉菌，只检出少量大肠菌群，均符合国家标准（≤5 CFU/mL）。而对照组贮藏至第7 天时大肠菌群数达15 CFU/mL，超出国家标准。因此，实验组能够显著抑制大肠菌群的生长。

在常温（20 ℃）贮藏期实验组未检出霉菌，只检出少量的大肠菌群，贮藏至第7 天大肠菌群数为4 CFU/mL，符合国家标准（≤5 CFU/mL），而对照组贮藏至第7天时大肠菌群数为10 CFU/mL，已超出国家标准。对照组贮藏至第7 天和第14 天时有金黄色葡萄球菌生长，可能是由于检测过程中受到污染所致。因此，实验组能够显著抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。

2.6 室温暴露试验

在发酵乳的生产过程中的质量问题有可能是因为霉菌污染造成的[30]。发酵乳室温暴露试验见结果如表6 所示，在室温条件下，将对照组放置第2 天就被检出霉菌（10 CFU/mL），而实验组到第5 天时才检出霉菌（10 CFU/mL）。因此，实验组具有抑制霉菌特性，尤其与菌株AJT 对真菌的抑制作用更为突出相吻合。

表6 常温条件下发酵乳中霉菌的变化

3 结 论

发酵乳的消费量日益增大，已成为人们生活中的重要乳制品之一。从广谱抗菌活性L.helveticus AJT 的发酵乳制备中的应用可知，菌株AJT 具有良好的发酵特性；菌株AJT 和S.thermophilus ST962 作为混合发酵菌种的发酵乳最优发酵条件确定为菌株AJT 和ST962 配比为1∶3，接种量4.0%（体积比），发酵温度42 ℃，蔗糖添加量6.0 g/mL；相比于对照组，实验组可抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，并且具有抑制发酵乳后酸化作用，其在4 ℃条件下可贮藏42 d，常温（20 ℃）条件下能够贮藏21 d。本研究结果为菌株AJT 的发酵乳应用研究提供实验数据。