阿克苏地区异常生鲜乳中芽胞杆菌的分离鉴定

张家浩，李莲瑞，刘祥杰，刑潇月，李虎，杨睿智

（1.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；3.新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆 阿拉尔 843300）

0 引 言

研究表明，生鲜奶中检出率最高、污染量最大的是芽胞杆菌属[1]。这类细菌在牛棚和饲料中较为常见，芽胞使其对高温和干燥的抗性较强。生庆海等[2]发现芽胞杆菌的酶能水解乳蛋白，使牛乳变酸、出现絮凝现象等。嗜冷菌广泛存在于牛乳的外部环境中，十分容易污染生鲜乳。而嗜冷菌产生的蛋白酶和脂肪酶经高温灭菌后仍保留活性，不仅会破坏乳的成分，影响原奶的品质和卫生，还会影响产品保质期[3]，对生产者的效益和消费者的权益均造成了损害。生鲜乳中微生物含量过高会导致生鲜奶腐败变质，甚至可导致食物中毒。生鲜奶中的致病菌产生的耐热毒素和芽胞可抵抗超高温瞬时灭菌技术（UHT）处理，残留的毒素会导致消费者中毒，而不能被杀灭的芽胞在保藏过程中会成为细菌的滋养细胞，进而在生牛奶中产酸产气。因此，检测生鲜乳中必需的微生物指标，对保证其质量和安全具有重要意义。

本研究从8 份异常生鲜乳中分离芽胞杆菌，对其进行相关研究并分析污染来源。同时进行微生物指标检测，对其质量进行评估。

1 材料与方法

1.1 样品来源

生鲜乳样品8 份依照GB/T 4789.1 规定的取样方法采集自新疆南疆某乳品企业，将采集的样品置于无菌锥形瓶中进行编号后，在3 h 内冰浴运回实验室，迅速进行分装、加热和稀释等预处理如表1 所示。

表1 新疆南疆阿克苏地区采集样品信息

1.2 试剂与仪器

试验试剂：MPC 琼脂培养基、平板计数琼脂（PCA）、DTA 培养基、BHI 培养基、TSA 培养基，青岛海博生物技术有限公司；核酸染料gold view，北京博奥拓达科技有限公司；琼脂糖、pMD-19T、DH5α、DL 2 000 DNA Marker，日本TaKaRa 公司，细菌微量生化鉴定管，MH 培养基、药敏纸片，杭州微生物试剂公司；氨苄青霉素（Ampicillin Na）、PBS 磷酸缓冲液、无菌水，甘油、孔雀绿溶液、95 %乙醇溶液、结晶紫溶液、碘液、0.5 %番红乙醇溶液由塔里木畜牧科技兵团重点实验室动物疫病防控研究室提供。

试验仪器：恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Eppendorf 5415-离心机，艾本德（上海）国际贸易有限公司；摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；超净工作台，上海博讯实业有限公司；水浴锅，上海博讯实业有限公司；PCR 仪，TC-5000/英国TECHNE公司；显微镜，日本尼康株式会社；加热制冷循环器，德国JULABO Laborteckmik G mbh；DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒，北京全式金生物技术有限公司；质粒小提试剂盒，天根生化科技有限公司；DYY-7C 型稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂；凝胶成像仪，Gel Doc TM XR+/Bio-RAD 公司；核酸蛋白检测仪，DS-11。

1.3 试验方法

1.3.1 异常生鲜乳中菌株的计数、分离和纯化

在超净工作台中，将异常生鲜乳分装入100 mL 无菌锥形瓶中（耐热芽胞计数需将生鲜乳置于99 ℃水浴30 min 后进行培养），用无菌水倍比稀释5 个梯度，涂布接种于DTA（55 ℃）、PCA（37 ℃）、MPC（37 ℃）琼脂培养基，倒置培养（48±2）h 后，计算耐热芽胞总数、芽胞总数和菌落总数；MPC（5 ℃）培养基倒置培养10 d后，计算嗜冷菌总数。选取形态不同的单菌落，在相应的固体培养基上多次划线纯化，通过革兰染色和芽胞染色镜检，选取有芽胞并显示为单一形态的单菌落，接种于BHI 液体培养基进行增菌培养，用于保菌和DNA 提取。

1.3.2 异常生鲜乳中芽胞杆菌的药敏试验

采用KB 纸片法，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈，判断分离菌株对12 种常用抗菌药物是否敏感。

1.3.3 异常生鲜乳中芽胞杆菌DNA 的提取

取增菌菌液多次离心，弃上清，提高菌体浓度，按照DNA 提取试剂盒说明书，提取DNA 保存于-20 ℃。

1.3.4 异常生鲜乳中芽胞杆菌的16S rDNA 基因的扩增

参照文献[4]合成细菌16S rRNA 基因通用引物。对OD260/280 检测合格的DNA，使用细菌通用引物进行PCR 扩增。PCR 扩增体系为：DNA 模板1 μL，EasyTaq SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 扩增程序：94 ℃，300 s；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，90 s；72 ℃，600 s；重复35 个循环，后使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。

1.3.5 PCR 产物的纯化

按照胶回收试剂盒说明书进行操作，纯化产物保存于-20 ℃。

1.3.6 目的基因与pMD-19T 载体连接、转化、克隆

取上步纯化产物0.5 μL、pMD-19T Vector 3.5 μL、Solution I 6 μL，放置于加热制冷循环器中，16 ℃过夜连接。将100 μL DH5α从-80 ℃取出化冻后与10 μL连接液混匀，冰浴30 min，42 ℃放置90 s，再次冰浴1～2 min，加入LB 液体培养基800 μL，37 ℃下，180 r/min培养1 h，8 000 r/min 离心2 min，弃上清850 μL 左右，将菌体吹打混匀，取100 μL 涂布于含Amp+（50 μg/mL）的琼脂平板培养基上过夜培养。挑取单菌落接种于含Amp+（50 μg/mL）的LB 液体培养基中，在37 ℃中，180 r/min 过夜培养。

1.3.7 提取质粒和质粒电泳鉴定

参照质粒小提试剂盒说明书进行操作提取菌液质粒，质粒DNA 用细菌通用引物进行PCR 扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，观察条带是否为目的条带。

1.3.8 测序

选取PCR 结果为阳性的质粒，送公司进行序列测定。

1.3.9 异常生鲜乳中芽胞杆菌的生化鉴定

选取乳糖、硫化氢等微量生化鉴定管，对分离菌株进行生化鉴定。

1.3.10 菌株16S rDNA 同源性及进化树分析

对所测得序列于NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）GenBank 数据库中进行比对鉴定[5]。用软件DNA star 对所测的4 株菌做系统进化树。

2 结果与分析

2.1 异常生鲜乳中微生物指标检测结果

微生物指标检测结果如表2 所示。

表2 新疆南疆阿克苏地区异常生鲜乳中微生物指标检测结果

由表2 可知，采集8 份异常生鲜乳样品中菌落总数、芽胞总数和耐热芽胞总数均符合GB 19301-2010《食品安全国家标准生乳》[6]，菌落总数在1.1×105～1.8×105之间，结果与胡忠华等对陕西省7 家乳企原料生乳计数结果相近[7]；而嗜冷菌总数均超过国家标准规定限值。

2.2 异常生鲜乳中芽胞杆菌的分离纯化结果

分离纯化结果如图1 所示。

图1 异常生鲜乳中芽胞杆菌菌落特征

分离株A、B：菌落呈奶油色，平到低凸，平展和半透明，具不规则的丝状边缘，表面粗糙皱褟。

分离株C：菌落呈微黄色，形态不规则，表面粗糙不透明，边缘隆起有褶皱。

分离株D：菌落呈乳白色，半透明，边缘整齐。

2.3 异常生鲜乳中芽胞杆菌的染色结果

菌体呈杆状，末端顿圆，革兰染色阳性，有椭圆形芽胞，疑似是芽胞杆菌，镜检结果如图2 所示。

图2 异常生鲜乳中芽胞杆菌革兰染色镜检结果（10×100）

由图2 可知，菌株经孔雀绿进行芽胞染色后，芽胞呈绿色，镜检结果如图3 所示。

图3 异常生鲜乳中芽胞杆菌芽胞染色镜检结果（10×100）

2.4 异常生鲜乳中芽胞杆菌的药敏试验结果

药敏试验结果如表3 所示。

表3 异常生鲜乳中芽胞杆菌的药敏试验结果

2.5 异常生鲜乳中芽胞杆菌的16S rDNA 扩增结果

提取菌株的DNA 的经核酸蛋白检测仪检测OD260/280 值均在1.8～2.0 之间，使用细菌通用引物进行PCR 扩增，将PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增条带约为1 500 bp，与期望大小相同，且清晰明亮，如图4 所示。

图4 异常生鲜乳中芽胞杆菌的16S rDNA 扩增结果

2.6 异常生鲜乳中芽胞杆菌的16S rDNA 克隆质粒鉴定结果

将经过增菌的克隆菌液提取质粒，经1%琼脂糖电泳鉴定，如图5 所示。

图5 异常生鲜乳中芽胞杆菌的16S rDNA 克隆质粒电泳结果

由图5 可知，以克隆质粒为模板扩增的16S rDNA 基因大小为与上步以芽胞杆菌为模板扩增的16S rDNA 基因大小相同，为1 500 bp 左右，可将克隆质粒进行测序。

2.7 异常生鲜乳中芽胞杆菌的16S rDNA 序列比对结果

将测得序列在NCBI 上进行序列比对，比对结果如表4 所示。由表4 可知，经NCBI BLAST 比对后，异常生鲜乳中4 株芽胞杆菌分离株鉴定为2 个属3 个种，分别为1 株枯草芽胞杆菌，2 株郭霍氏芽胞杆菌，1株灿烂类芽孢杆菌。

表4 异常生鲜乳中芽胞杆菌序列比对结果

2.8 异常生鲜乳中芽胞杆菌的生化鉴定结果

生化鉴定结果如表5 所示。

表5 异常生鲜乳中芽胞杆菌的生化鉴定结果

根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》[8-9]，根据分菌株的形态、生理生化特征和序列比对结果，鉴定A、B、C 分离菌为芽胞杆菌属，D 分离菌为类芽胞杆菌属。

2.9 异常生鲜乳中芽胞杆菌的分离结果

分离结果如表6所示。

表6 新疆阿克苏地区异常生鲜乳中芽胞杆菌的分离结果

2.10 芽胞杆菌系统发育树的构建及分类

由图3、4 可知，菌株A、B、C 同属一个大分支，为芽胞杆菌属，菌株D 为外缘支，为类芽胞杆菌属。菌 株 A、B 与 登 录 号 为 FR845720、MH819661、FR845721、FN995265、MN075515、MF177864、MT507 233 的郭霍氏芽胞杆菌模式株和登录号为CP022983的郭霍氏芽胞杆菌全基因组处于同一分支，且同源性均高于99.3 %，故将菌株A、B 鉴定为郭霍氏芽胞杆菌；菌株C 与登录号为ON000821、OM996102、ON358234、OM996107、ON012959、ON340723 的枯草芽胞杆菌模式株处于同一分支，且同源性均高于99.5 %，故将菌株C 鉴定为枯草芽胞杆菌；菌株D 与登录号为MT790713、KT719471、KT719472、JF798384、LC588626、MW435484 的灿烂类芽胞杆菌模式株处于同一分支，且同源性均高于99.6 %，故将菌株D 鉴定为灿烂类芽胞杆菌。菌株系统发育树和同源性分析，见图6、图7。

图6 系统进化树

图7 同源性分析

3 讨 论

食品中的微生物污染和变质不仅对消费者的健康构成威胁，还在工业中造成大量的经济损失。特别是形成芽胞的细菌，它们在食品中具有耐热性，并能耐受干燥和消毒室中无机消毒剂、有机溶剂和紫外线的处理，污染乳制产品。许多国家的原料乳中都发现并分离到芽胞杆菌[10]。郭霍氏芽胞杆菌是Seiler Herbert[11]等2012 年在德国南部的两个奶牛场的产品中首次分离得到，是芽胞杆菌属的一个新种，与本试验分离的样本类型一致。后来陆续有关于该菌的报道，C.Chellaram[12]、Kenneth H.Wan[13]、Rozhan Feizi[14]等分别从海扇珊瑚、果蝇肠道、堆肥和污水中分离得到，说明其在自然界分布广泛。Shih-Keng Loong[15]等从大鼠的充血雌性硬蜱中分离出一株灿烂类芽胞杆菌, 表明该菌是条件致病菌, 可能通过蜱虫叮咬传播给人类或其他宿主而引起菌血症。人类感染灿烂类芽胞杆菌虽然罕见,但由于其潜在的致病性，我们必须保持警惕，做好清洁和消毒工作，同时改进废物处理方法，避免吸引啮齿类动物。枯草芽胞杆菌在牛舍中普遍存在，污物粪便和粉尘等经常会将枯草芽胞杆菌带入奶中[16]。在环境里常见的病原体中，芽胞杆菌属和类芽胞杆菌属的细菌病原体是普遍存在的，虽然这两个属的成员在农业和工业上有有益的应用，但很少有报道称其是乳制品腐败的病原体[15]。

牛奶中微生物的含量是评价奶品质的一个重要参考数据。如果乳品中微生物总数高，其中的致病菌会产生外毒素，人们饮用后很容易引起食物中毒，且细菌大量繁殖会引起牛奶酸败，蛋白质热稳定性下降等问题。因此将这些微生物控制在国标规定的范围之内，才能生产出优质的乳制品。嗜冷菌污染是影响乳制品贮存期限的最主要因素，其广泛存在牛乳的外部环境中，遇晓杰等[17]发现原料乳中自身嗜冷菌的数量有限，嗜冷菌超标主要来源于外源性污染[18]。奶牛乳房表面易被粪便、土壤等污物污染，如果挤奶前未对其清洗或清洗不严格，污物上的细菌和芽胞会随牛奶进入生鲜奶储存罐，这也是芽胞进入原料乳中的主要方式[18]。本试验采集8 份异常生鲜乳样品中芽胞总数较少，而且挤奶设备、运输奶的管道和储存奶的容器都是刚引进的新设备，因此怀疑污染源来自奶牛乳房和其所处环境，或是收奶过程中受到空气中微生物的污染。何开兵[19]对新疆石河子生鲜牛乳微生物状况进行检验，发现所检牛场微生物污染严重。控制原料乳中的有害微生物是每个奶牛场的重点工作内容，牛体乳房的清洗护理、奶牛所处环境的卫生质量，运输奶的管道和奶储存容器的消毒，以及正确规范的挤奶操作等各个环节都对减少原料乳中的微生物有着至关重要的作用。

4 结 论

本试验从阿克苏地区两家奶牛场采集的8 份生鲜乳中嗜冷菌污染较严重，超过国家标准规定限值，同时通过实验室常规纯培养方法分离得到4 株菌株，经16S rDNA 和生化实验鉴定为Bacillus kochii、Bacillus subtilis 和Paenibacillus lautus。该乳品受郭霍氏芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和灿烂类芽胞杆菌污染，耐药性较弱，至于其是否存在毒力基因需作进一步研究。