前列腺癌中丝氨酸苏氨酸激酶-1 和驱动蛋白-5 蛋白表达及相关性研究

罗荣利，徐 旻，张春霆

前列腺癌日趋年轻化，是危害男性健康的疾病之一[1]。前列腺癌演化进展与基因异常表达有关[2-3]。驱动蛋白-5（Eg5）基因增高通过干扰纺锤体组装进而影响染色体的动态平衡，促进肿瘤增殖[4-5]，丝氨酸苏氨酸激酶-1（PIM-1）表达增高，进而促进肿瘤细胞增殖、侵袭和细胞周期改变[6-7]。对肿瘤Oncomine 数据库进行检测验证发现，PIM-1 和Eg5基因在前列腺癌发生进展中有相关性，但它们在前列腺癌中的作用尚不清楚。本研究采用免疫组化SP法检测前列腺癌中PIM-1 和Eg5 蛋白表达，探讨其与前列腺癌临床病理特征之间的关系及相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016 年1 月—2017 年6 月浙江大学医学院附属金华医院/金华市中心医院泌尿外科收治的81 例前列腺癌患者，年龄49～83 岁，平均67.1 岁；选取同期收治的43 例前列腺增生患者，年龄48.5～84 岁，平均66.9 岁，采用Gleason 分级评价其分化程度，Gleason 评分≤8 分的46 例，Gleason 评分＞8 分的35 例。按照2002 年AJCC 临床TNM 分期标准，Ⅰ～Ⅱ期47 例，Ⅲ～Ⅳ期34 例。所有前列腺癌患者术前均未接受放疗、化疗和内分泌治疗。所有参与研究的患者均在本院签知情同意书。

1.2 采用免疫组化法检测PIM-1 和Eg5 蛋白表达水平 免疫组化染色所用SP 试剂盒和DAB 显色剂均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，货号：SP0041。实验按照试剂盒说明书进行。所有标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，3 μm 厚连续切片，以3%过氧化氢溶液室温孵育10 min，常规封闭，后由二甲苯进行脱蜡后，依次梯度乙醇水化。加入兔抗人Eg5 一抗（浓度1∶100，规格：100 μL，货号：CSBPA182810，购于武汉博士德公司），4 ℃孵育过夜，PBS 洗3 次，每次5 min；滴加二抗（生物素标记）室温孵育30 min；PBS 洗3 次，每次5 min；经DAB 显色，苏木素复染，最后封片、光镜观察，并使用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照；PIM-1 免疫组化实验同Eg5，PIM-1 为兔抗人多克隆抗体（浓度1∶150，规格：100 μg，货号：3787R-100）。

1.3 免疫组化染色结果判定 PIM-1 和Eg5 蛋白主要定位表达在细胞质，而在胞浆及胞核中少量表达。根据高倍镜下100 个细胞中阳性表达细胞数判断免疫组化结果：（-）为阴性，阳性细胞表达细胞数＜10%为（+），阳性表达细胞数10%～25%（++），阳性表达细胞数25%～50%为（+++），＞50%为（++++），阳性细胞数在（+++）以上为PIM-1 和Eg5 蛋白表达阳性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 26.0 进行统计分析，计数资料以例表示，比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman 相关性分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PIM-1 和Eg5 蛋白在前列腺癌中的表达情况免疫组化染色结果发现，PIM-1 蛋白和Eg5 蛋白主要表达在细胞质，而在细胞膜中少量表达。见图1。

图1 PIM-1 和Eg5 蛋白在前列腺癌和前列腺增生中的表达

2.2 PIM-1 和Eg5 在前列腺癌中表达与前列腺癌患者临床病理特征之间的关系 PIM-1 蛋白在前列腺癌中表达阳性率为67.90%（55/81），在前列腺增生中表达阳性率为32.56%（14/43），差异有统计学意义（P＜0.01）。Eg5 蛋白在前列腺癌中表达阳性率为64.20%（52/81），在前列腺增生中表达阳性率为23.26%（10/43），差异有统计学意义（P＜0.05）；PIM-1 蛋白在前列腺癌Gleason≤8 分表达阳性率为58.70%（27/46），在Gleason＞8 分表达阳性率为80.00%（28/35），差异有统计学意义（P＜0.05）。Eg5在前列腺癌Gleason≤8 分的表达阳性率为54.35%（25/46），在Gleason＞8 分表达阳性率为77.14%（27/35），差异有统计学意义（P＜0.05）；在Ⅰ～Ⅱ期表达率74.47%（35/47）和Ⅲ～Ⅳ期阳性表达率为50.00%（17/34），差异有统计学意义（P＜0.05）；Eg5 在前列腺癌5 年生化复发表达阳性率为77.78%（28/36），在5 年无生化复发表达阳性率为53.33%（24/45），差异有统计学意义。见表1。

表1 PIM-1 和Eg5 蛋白表达与前列腺癌患者临床病理特点的关系

2.3 PIM-1 与Eg5 蛋白在前列腺癌中表达情况的相关性分析 在前列腺癌中，PIM-1 与Eg5 蛋白表达阳性率呈正相关（r=0.825，P<0.05），见图2。

图2 前列腺癌中PIM-1 和Eg5 蛋白表达的相关性分析

3 讨论

前列腺癌起病隐匿，发生机制复杂，进展后发展快，前列腺癌是与基因有关的疾病[8]。PIM-1 激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员一员，在癌症的进展和发展中起着非常重要的作用[9]。有研究支持抑制PIM-1 是抑制肿瘤细胞增殖的有效途径[10]。PIM-1激酶增高表达在各种类型的癌症中，包括膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌等[11-13]。在前列腺癌中，虽然PIM-1呈现过度表达，但其在前列腺癌中作用的研究尚未清楚。Eg5 基因是细胞有丝分裂周期中一个重要的驱动蛋白基因，在细胞分裂中起重要作用[14]。Eg5 过度表达会干扰纺锤体构建，使纺锤体形成受到影响[15]。相关研究已经证实，Eg5 增高可促进肿瘤细胞增殖和侵袭[16-17]，但在前列腺癌中PIM-1 与Eg5 表达相关性未见报道。

本研究采用免疫组化法对前列腺癌中PIM-1和Eg5 蛋白的表达状况及相关性进行研究，结果发现前列腺癌中PIM-1 和Eg5 蛋白呈高表达，它们的高表达与前列腺癌临床分期和Gleason 分级、术前PSA、5 年生化复发有关，与患者年龄无关。Eg5 参与免疫调节与T 细胞有关，阻断了CD4 阳性T 淋巴细胞可导致细胞死亡[18]。进一步研究发现Eg5 也对蛋白质翻译、癌细胞迁移、神经元存活和新生血管生成中有重要作用[19-20]。然而，现有的研究仅提示Eg5可能在肿瘤的发生演化中扮演着重要的作用，在前列腺癌中是否有相同的作用需要进一步体内外研究证实。有研究对Eg5 在膀胱癌细胞系研究中显示，膀胱癌T24 细胞株中增高表达的Eg5 促进了膀胱癌T24 细胞的增殖和迁移，靶向沉默Eg5 有效地抑制了膀胱癌T24 细胞增殖与迁移[21]，但对其确切的机制并未进一步深入研究。

前列腺癌中PIM-1 增高表达与其临床相关性已经得到证实，PIM-1 抑制剂可以明显抑制前列腺细胞增殖和侵袭，PIM-1 抑制剂可能通过多种肿瘤抑制途径有效抑制肿瘤细胞增殖[22]。本研究对PIM-1 与Eg5 蛋白在前列腺癌中表达相关性进行了研究，发现在前列腺癌中二者呈正相关，说明它们在前列腺癌中共同作用于前列腺癌的发生和进展。

总之，PIM-1 与Eg5 蛋白在前列腺癌中呈现高表达，这种高表达共同引发前列腺肿瘤发生和进展。但PIM-1 与Eg5 在前列腺癌中确切的作用机制未明，有必要进一步采用体内及体外实验研究它们在前列腺癌细胞系中的表达模式及作用方式，为前列腺癌的治疗探寻一条新靶向治疗的有效指标。