原发性肾病综合征儿童外周血CD14 单核细胞TLR2 的表达及其与IL-7 表达水平的相关性分析

彭文娟，刘京涛，李晓琳

（三门峡市中心医院儿科，河南 三门峡 472000）

儿童原发性肾病综合征（Idiopaticnephrotic syndrome，INS）是儿科最常见的肾小球疾病，占小儿肾病综合征总数的90%以上，典型表现为大量持久的蛋白尿、高度水肿、低蛋白血症及高脂血症等症状[1]。INS 的常见病因为感染、遗传、免疫等因素，患者肾脏一般不能完全恢复为正常功能且复发率也比较高。病程延长，是患病儿童肾脏发生衰竭的较为重要的原因之一[2]。多数肾小球肾炎的发病机制是免疫炎症功能紊乱[3]。Toll 样受体2（Tolllike receptor 2，TLR2）为Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）家族成员，结构上属于Ⅰ型跨膜受体蛋白，其通过识别与病原有关的分子模式和某些内源性配体，从而导致信号转导，炎症介质被释放[4]。既往研究显示，Toll 样受体可能通过炎性反应这一途径介导肾组织的损伤过程，且与INS 病情活动具有相关性[5-6]。白细胞介素-7（Interleukin-7，IL-7）主要通过IL-7 受体α 链发挥作用，可以调控并维持免疫细胞分化、发育和增殖，在感染、肿瘤、自身免疫性疾病中扮演着关键的角色[7]。既往研究显示，IL-7 可以强化CD14 单核细胞的功能，在INS 中发挥促进炎症的效果、诱导疾病进展的作用[8]。基于此，我们推测INS 外周血CD14 单核细胞TLR2 与IL-7 等炎症因子可能通过某种机制相互调节，共同参与了INS 发生、发展。本研究探讨INS外周血CD14 单核细胞TLR2 的表达及其与IL-7表达水平，分析二者相关性，以期为临床治疗提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019 年1 月到2021 年1 月在本院收治的112 例被确诊的INS 患儿作为观察组，其中男53 例，女59 例，年龄2～16 岁，平均（8.22±2.78）岁。病理学分类：微小病变（Minimal changing disease，MCD）49 例，系膜增生性肾小球肾炎（Mesangial prolif-erative glomerulonephritis，MsPGN）27 例，膜性肾病（Membranous nephropathy，MN）19 例，局灶节段性肾小球硬化（Focal segmental glomerulus sclerosis，FSGS）17 例。纳入标准：（1）符合《儿童常见肾脏疾病诊治循证指南》[9]诊断标准；（2）血清白蛋白含量低于25 g/L，24 h 尿蛋白定量超过50 mg/(kg·d)，尿蛋白大于3+，伴有水肿等临床症状；（3）肾脏生物检查组织学切片肾小球总数超过20 个；（4）不伴其他自身免疫性疾病。排除标准：（1）先天性或遗传性肾病综合征患儿；（2）继发于糖尿病、乙肝丙肝、多发性骨髓瘤等继发性肾病综合征患儿；（3）合并严重疾病，如自身免疫、肝脏和造血系统等疾病；（4）对本研究所用药物过敏的患儿；（5）临床资料不完整患儿。对照组另选同期体检的健康儿童112 例，其中男54 例，女58例，年龄3～15 岁，平均（8.84±2.51）岁。本研究通过医院伦理委员会，患者及家属了解并同意。

1.2 主要试剂和设备 FACS Calibur 流式细胞分析仪购自美国Becton-Dickinson 公司；流式专用试管购自上海百赛生物有限公司；罗氏cobas6000 C501 全自动生化仪购自德国罗氏公司；医用低速离心机购自德国Heraeus 公司；小鼠抗人CD14 单抗（荧光素PC-5 标记）、IgG2a 同型对照、FITC 标记小鼠抗人TLR2 单抗均购自北京百奥莱博科技有限公司；所用ELISA 试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；所用免疫比浊法试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 INS 患儿外周血CD14 单核细胞TLR2 检测方法 采集所有患儿清晨空腹静脉血3 mL，置于EDTA 管中，具体检测步骤：首先，取三支样品测定管并标记为A、B、C，加入抗凝血剂100 μL，再加入受体封闭剂5 μL。涡旋器振荡，混匀并在暗室中孵育10 min；然后，在A、B 管中均加入PE-IgG2a 5 μL，在B、C 管中均加入FITC-CD14 20 μL，最后在A、C 管中分别加入FITC-IgG1 20 μL、PE-TLR2 5 μL，振荡混匀，室温暗室培养20 min；A、B、C 管中均加入500 μL 红细胞裂解液后，振荡混匀并在室温下避光10 min；最后，进行离心，转速1 500 r/min，离心半径15 cm，离心5 min，弃上清液，加入PBS 液2 mL，振荡混匀，再1 500 r/min，离心5 min，弃上清液，加入PBS 液500 μL，振荡混匀，应用FACS Calibur 流式细胞仪上机检测，同时建立无标记抗体的阴性对照。在运行机器之前，使用标准荧光微球调整仪调节对应的变异系数。测试后，使用Cell quest 软件进行检测。TLR2 的表达率计算方式为：CD14 和TLR2 抗体染色的双阳性细胞百分比。

1.4 INS 患儿血清学指标检测方法 采集所有患儿清晨空腹静脉血5 mL，使用低温离心机进行离心，转速2500 r/min，离心半径15 cm，离心10 min，吸取其上清液，然后将其放于-80 ℃冰箱中保存待测。

应用罗氏cobas6000 C501 全自动生化仪，采用免疫比浊法测定血浆高敏C-反应蛋白（High sensitive c-reactive protein，hs-CRP）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）水平；采用ELISA 检测法测定血清白介素-7（Interleukin-7，IL-7）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）及肿瘤坏死因子-α（Tumer necrosis factor-alpha，TNF-α）水平，操作过程严格按照试剂盒说明进行。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行分析，满足正态分布的计量资料均以（）表示，采用t 检验分析比较两组间差异性；计数资料均以率(%)表示，分类资料之间比较采用χ2检验；采用Pearson 相关性分析INS 患儿外周血CD14 单核细 胞TLR2 的表达及其与IL-7、hs-CRP、IgG、IgM 表达水平的相关性；绘制受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve，ROC），计算ROC 曲线下面积（Area under curve，AUC），评估TLR2、IL-7 对INS 患儿发病的预测价值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和对照组血清hs-CRP、IgG、IgM 水平比较 两组血清hs-CRP、IgG、IgM 水平比较具有统计学差异（P＜0.05），见表1。

表1 两组血清hs-CRP、IgG、IgM 水平比较

2.2 两组TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表达水平比较 观察组外周血CD14 单核细胞TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表达水平均显著高于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 两组TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表达水平比较

2.3 INS 患儿TLR2 与IL-7 表达水平的相关性分析 INS 患儿外周血CD14 单核细胞TLR2 与IL-7表达水平呈正相关（r=0.479，P＜0.001），见图1。

图1 INS 患儿TLR2 与IL-7 表达水平的相关性分析

2.4 INS 患儿TLR2、IL-7 与hs-CRP、IgG、IgM、IL-6、IL-8、TNF-α 相关性分析 INS 患儿外周血CD14 单核细胞TLR2 与hs-CRP、IL-6、IL-8、TNFα 呈正相关（P＜0.05）；血清IL-7 与IgG 呈负相关，与hs-CRP、IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相关（P＜0.05）；而TLR2、IL-7 与IgM 均无相关性（P＞0.05）。见表3。

表3 INS 患儿TLR2、IL-7 与hs-CRP、IgG、IgM、IL-6、IL-8、TNF-α 相关性分析

2.5 ROC 曲线分析TLR2、IL-7 对INS 患儿发病的预测价值 TLR2、IL-7 及联合检测预测INS 患儿发病的AUC 分别为0.714、0.674、0.908。见图2、表4。

图2 TLR2、IL-7 对INS 患儿发病的预测价值ROC 曲线图

表4 TLR2、IL-7 及联合指标的ROC 曲线分析

3 讨论

INS 是儿童常见的肾小球疾病，其主要原因是肾小球毛细血管及基底膜的通透性增加，大量血浆蛋白经尿流失，肝脏合成脂蛋白增加，这些因素综合导致了儿童肾衰竭的发生[10]。目前，INS 的病因和发病机制尚未完全清楚。已有研究显示，机体细胞和体液免疫功能异常可能是导致发病主要原因，且TLRs 对INS 的发生、发展起重要作用[11]。本研究分析了INS 患儿的一般资料，发现血清hs-CRP、IgM 水平高于对照组，IgG 水平低于对照组。已有研究显示，hs-CRP 是一种非常敏感的炎症标志物。当机体发生炎症感染，或者遭体液介导的免疫应答导致的组织损伤时，血液中的CPR 在很长一段时间内保持在高水平[12]。而IgM 是一种高分子蛋白，其不容易通过肾小球滤过膜，当机体发生炎症反应时其浓度上调。所以IgM 的增加也可能与INS 患儿的继发感染有关。IgG 降低可能与INS 患儿加速分解、尿中丢失增加、淋巴细胞合成的减少和免疫抑制剂的应用相关[13-14]。结合本研究说明，hs-CRP、IgM 及IgG 可以分别以不同的方式参与儿童INS 的发病，并在发病中起到一定作用。

TLR2 是特异的I 型跨膜受体和病原模式识别受体，在炎症反应、细胞信号的传达、衰亡中扮演着重要的角色[15]。IL-7 是趋化因子家族中的成员之一，是骨髓基质细胞分泌的糖蛋白细胞因子，分子量为25KD，能够促进趋化因子分泌、募集炎症因子[16]。既往研究显示，IL-7 可以加速INS 患儿CD14单核细胞炎症细胞因子的分泌。IL-7 刺激的CD14单核细胞均可通过直接或接触的方式，诱导IL-6分泌从而使INS 患儿CD4+T 细胞活化[17]。本研究结果显示，INS 患儿外周血CD14 单核细胞TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表达水平均显著高于对 照组，且TLR2 与IL-7 表达水平呈正相关性。分析原因，这可能是由于INS 患儿机体TLR2 识别了某些内源性抗原，通过细胞内信号转导途径诱导人单核细胞激活NF-кβ，核内的相关基因被启动，传导出相应的mRNA，从而合成IL-7、IL-6、IL-8、TNFα 等细胞因子并释放到胞外，引起炎症反应。既往研究显示，TLR2 与其配体结合以后，激活下游信号转导分子，引起炎性因子的释放，使肾小球基底膜通透性增强，导致大量蛋白尿的产生[18]。结合本研究说明，外周血CD14+单核细胞TLR2、IL-7 与INS 的发生有密切关系，TLR2 可以通过炎性反应这一途径参与并调控肾组织的损伤过程。

本研究结果还显示，INS 患儿外周血CD14 单核细胞TLR2 与hs-CRP、IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相关；血清IL-7 与IgG 呈负相关，与hs-CRP、IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相关。既往研究显示，TLRs 还可以刺激和调节B 淋巴细胞表面标志物的表达，促进B 淋巴细胞增殖、细胞因子分泌和Ig 分泌功能[19]。结合本研究说明，T 淋巴细胞亚群和细胞炎症因子均可能参与INS 的发生和发展。T 淋巴细胞分泌的细胞因子在INS 患儿机体内会出现异常表达，其表达结果与健康儿童不同，同时还会介导相关细胞的免疫应答过程，在儿童体内进而引发超敏反应。通过ROC 曲线分析发现，TLR2、IL-7 联合检测INS 患儿发病的灵敏度、特异度最高，AUC 面积最大，且有较好的灵敏度和特异性，具有较大预测价值，提示外周血CD14 单核细胞TLR2、IL-7 在INS 发病中均起到一定作用。

综上所述，INS 患儿外周血CD14 单核细胞TLR2、IL-7 表达水平均明显上调，且两者具有正相关性，TLR2、IL-7 联合检测对判定INS 发病具有较高的预测价值。但本文还存在一定的不足之处，可进一步探讨INS 患儿外周血CD14 单核细胞TLR2调控的信号通路，以期为临床诊断和治疗INS 患儿提供可靠依据。