不同种类呼吸道样品活体检测猪肺炎支原体抗原和抗体的比较分析

甘源，苏丽娟，韦艳娜，武昱孜，林昌华，覃秀珍，黄海权，白昀，邵国青，熊祺琰，冯志新*

(1. 江苏省农业科学院兽医研究所，农业农村部兽用生物制品工程重点实验室，江苏 南京 210014；2. 广西桂垦西江牧业有限公司，广西 贵港 537100)

猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起猪支原体肺炎(mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)的主要病原，不同品种、不同日龄的猪群均可感染，主要表现为咳嗽、气喘、消瘦和生长迟缓等临床症状，也是猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)[1-3]的主要病原体之一。Mhp主要定殖在气管、支气管和细支气管的黏膜表面[4]，通过破坏上皮表面的纤毛，影响黏膜的清除系统和呼吸道免疫系统功能，导致猪群的免疫力下降和饲料转化效率的降低，严重危害养猪业的健康发展。因此，在猪群感染早期，活体检测猪肺炎支原体对于及时实施控制措施至关重要。然而在实际的生产中，由于猪肺炎支原体主要定殖在下呼吸道，进行活体采样操作和早期的诊断会更为复杂，部分临床样品无法实现活体采样或在活体状态下样品采集不易操作导致样品可靠性难保证，其检测结果还可能受猪群的感染背景、检测方法、样品类型和采集时间等因素的影响[5-7]，基于ELISA技术的血清抗体检测法虽然是一种经济且常用的方法，但由于Mhp感染后血清抗体转阳较迟，且无法区分所检测的血清抗体是疫苗抗体还是野毒抗体，以及在哺乳与保育早期也无法区分母源抗体还是感染抗体，故临床上对血清抗体的检测不能准确用于Mhp感染的诊断[8-9]。课题组曾建立了特异性黏膜sIgA抗体检测技术[10-11]，可区别母源抗体、灭活疫苗抗体和感染抗体，已用于Mhp的感染诊断。在分子检测方面，实时定量PCR技术是目前Mhp感染诊断的主要方法[1，12]，可从猪肺炎支原体的靶组织，如气管[7]、支气管[13]和肺脏[14]，以及运用临床拭子样品，如喉拭子[5]、鼻拭子[15]、气管拭子和咽拭子[13]进行猪肺炎支原体检测。然而，喉拭子只是在试验感染条件下评估过[5，16-17]，在临床条件下鲜见报道[6]。另外，相较于气管拭子样本，来源于自然感染Mhp的育肥猪场的咽拭子样本存在较低的抗原阳性率[13]。鼻拭子样本具有采集简单易操作、对机体损伤较小等优点，可通过检测鼻拭子样品的Mhp sIgA黏膜抗体和抗原来评估实际生产中不同生产阶段猪群的免疫和感染状况[18]。

由于受猪群的感染背景、检测方法、样品类型和采集时间等因素的影响，不同样品的检测结果往往缺乏一致性。目前尚缺乏活体采集的鼻拭子、喉拭子和咽拭子样品中Mhp黏膜sIgA抗体和抗原检测结果的系统比较数据，对于Mhp感染的检测缺乏统一的方法与标准。本研究针对以上问题，通过ELISA和实时定量PCR方法检测来源于某大型养殖场不同生产阶段猪群的鼻拭子、喉拭子和咽拭子样品中Mhp黏膜sIgA抗体和抗原，并对数据加以比较分析，以探求在自然感染情况下，在不同检测方法、感染时间和样本类型中Mhp黏膜sIgA抗体分泌和抗原留存规律，为Mhp在流行病调查和净化策略的实施过程中如何选择可靠有效的临床样品提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

鼻拭子、喉拭子和咽拭子样品全部来源于广西某大型养殖场的断奶仔猪群、保育猪群(60日龄)、育肥猪群(120日龄)、屠宰猪群、后备猪群和种猪群，每头猪均采集2～3种样品(具体品种及数量见表1)，样品采集遵循全覆盖、随机性、可靠性的原则。

表1 不同生产阶段猪群3种样品中Mhp sIgA抗体检测结果

1.2 主要试剂

猪肺炎支原体sIgA黏膜抗体检测试剂盒由江苏省农业科学院兽医研究所提供；猪肺炎支原体qPCR检测试剂盒购自麦诺迪(上海)生物科技有限公司；拭子浸泡液由江苏省农科院兽医研究所提供。

1.3 样品采集及处理

1.3.1 鼻拭子

参照冯志新等[19]方法采集鼻拭子，体型较大猪群需借助保定器，鼻拭子样品采集完成后将拭子插回装有拭子浸泡液的样品收集管中并做好标记。样品处理：将收集的鼻拭子样品在2～8 ℃浸泡2 h以上，在涡旋振荡器上震荡5 s 后，用1 mL移液器尽量吸出鼻拭子浸液，12 000 r/min离心10 min，取上清液用于Mhp黏膜sIgA抗体检测，取沉淀用于Mhp抗原检测。

1.3.2 咽拭子

采样前停水2 h，采样时先打开猪用一次性咽拭子采样器(50 cm长)，注意采样器头部不能随意碰触其他物品，手部握住咽拭子采样器最末端，沿着上颚缓慢伸入至双侧咽扁桃体和咽后壁处，至手部不能再进入为准，轻轻拭擦2～3次后抽出，将采样器头部折断至装有拭子浸泡液的样品收集管中并做好标记。样品处理参照鼻拭子样品的处理方法。

1.3.3 喉拭子

根据动物的体重选择人工或保定器将猪固定后，一人使用开口器打开猪的上下颚，另一人左手使用喉镜的叶片固定舌头，右手握住加长的咽拭子采样器(70 cm)的末端，沿着上颚缓慢伸入至手部不能再进入为准，上下滑动2～3次和左右旋转2～3次后缓慢取出，将采样器头部折断至装有拭子浸泡液的样品收集管中并做好标记。样品处理参照鼻拭子样品处理方法。

1.4 Mhp黏膜sIgA检测方法

参照Feng等[10]建立的猪肺炎支原体sIgA检测方法，用猪肺炎支原体sIgA-ELISA抗体检测试剂盒，检测鼻拭子、喉拭子和咽拭子样品上清液中的Mhp特异性sIgA抗体。在酶标仪上读取OD450 nm值，S/P值=(样品OD450 nm平均值-阴性对照OD450 nm平均值)/(阳性对照OD450 nm平均值-阴性对照OD450 nm平均值)。

1.5 Mhp抗原含量检测方法

用柱式或磁珠提取法提取样品中的DNA后，参照猪肺炎支原体荧光PCR检测试剂盒操作流程进行荧光PCR反应。反应体系20 μL：PCR反应液15 μL，P溶液2 μL，待检DNA溶液3 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，进行45个循坏。Ct值≤38的样本判定为阳性。利用猪肺炎支原体荧光定量PCR方法检测鼻拭子、喉拭子和咽拭子样品沉淀中Mhp抗原的含量。

2 结果与分析

2.1 不同生产阶段猪群3种样品中Mhp黏膜sIgA抗体阳性率的比较

检测了不同生产阶段猪群的鼻拭子、喉拭子和咽拭子样品中Mhp sIgA抗体，共计872份，3种样品的总体黏膜抗体阳性率为57.34%(表1)，其中鼻拭子、喉拭子、咽拭子的阳性率分别为63.23%、62.55%、47.27%(图1)，且针对同一头猪的鼻拭子、喉拭子和咽拭子的检测结果在屠宰猪表现出较高的符合率(符合率指同一头猪不同样品检测均为阴性或者阳性数与总样品数的比值)，而在断奶仔猪、保育猪及后备猪的检测符合率较低，尤其是咽拭子的阳率性普遍较低(表1)。从不同的生产阶段看，保育猪和屠宰猪群中Mhp黏膜sIgA抗体阳性率较高，而断奶仔猪群中Mhp黏膜sIgA抗体阳性率最低。鼻拭子样品相较喉拭子和咽拭子样品，Mhp黏膜sIgA抗体的检出率更高(图2)。

图1 3种样品的Mhp sIgA抗体检测结果

图2 不同生产阶段猪群3种样品的Mhp sIgA抗体检测

2.2 不同生产阶段猪群3种样品中Mhp抗原阳性率的比较

将不同生产阶段猪群的鼻拭子、喉拭子和咽拭子样品按照样品种类进行随机混样检测Mhp抗原，共计286份混合样品，3种样品的总体抗原阳性率为68.18%(表2)。其中鼻拭子、喉拭子、咽拭子的阳性率分别为74.75%、65.91%、63.64%(图3)。

图3 3种样品的Mhp抗原检测结果

表2 不同生产阶段猪群3种样品中的Mhp抗原检测结果

从不同的生产阶段看，断奶仔猪阶段的鼻拭子和咽拭子均未检出Mhp抗原，Mhp抗原的检出率随着猪群生产日龄的增加而增加，屠宰猪群和后备猪群鼻拭子和喉拭子中Mhp抗原阳性率达到峰值，种猪群的抗原检测率出现了下降(图4)。鼻拭子相较喉拭子和咽拭子样品，Mhp抗原的检出率在育肥猪群、屠宰猪群、后备猪群和种猪群均更高。

图4 不同生产阶段猪群3种样品的Mhp抗原检测

2.3 不同生产阶段猪群鼻拭子样品中Mhp黏膜sIgA抗体和抗原阳性率的比较

由图5可见，在断奶仔猪群的鼻拭子中可检出Mhp黏膜sIgA抗体，但Mhp抗原未检出；在保育猪、屠宰猪、后备猪和种猪群阶段的鼻拭子中既可检出Mhp黏膜sIgA抗体，也可检出Mhp抗原。其中，断奶仔猪、保育猪至屠宰猪阶段的鼻拭子Mhp黏膜sIgA抗体阳性率均高于Mhp抗原阳性率，而后备猪群的鼻拭子Mhp抗原阳性率高于Mhp黏膜sIgA抗体阳性率，种猪群的鼻拭子样品中Mhp黏膜sIgA抗体和Mhp抗原阳性率相当。

图5 鼻拭子的Mhp抗原和抗体阳性率对比

3 讨论

黏膜和黏膜免疫系统共同构成了机体抵抗病原体入侵的重要屏障。目前的研究结果表明，绝大多数的病原感染或感染初期发生在黏膜表面[20]。黏膜免疫产生的抗体主要以sIgA为主[21]。sIgA抗体的分子结构稳定，能够适应黏膜表面复杂的环境，猪肺炎支原体特异性sIgA抗体在感染后可持续9～19周[22]。鼻拭子样本已被应用于早期感染的黏膜病原和抗体检测[23-24]。本次研究结果显示，Mhp感染后各生产阶段猪群鼻拭子中黏膜sIgA抗体检出率最高，喉拭子样品次之，咽拭子最低。这可能与3种样品中内容物的组成差异有关，鼻拭子样品主要以呼吸道分泌液为主，而咽拭子样品中以唾液为主。研究结果说明，鼻拭子样品对于检测Mhp黏膜sIgA抗体具有普遍适用性，可用于各个生产阶段猪群的监测。对于不同生产阶段的猪群，鼻拭子与喉拭子样品中Mhp黏膜sIgA抗体阳性检出率也有所不同，从断奶仔猪到保育、屠宰阶段持续上升，随着日龄上升，后备、种公母猪阳性率逐渐下降，这与以前我们对Mhp人工感染条件下黏膜sIgA抗体分泌规律研究结论一致[22]。这种现象与临床上Mhp自然感染后的流行动态也基本一致，提示临床上规模猪场对于猪肺炎支原体的感染控制需结合科学的饲养管理模式，如通过早期断奶减少由母猪传染至仔猪的机率，或通过全进全出的生产体系以及在断奶转群等节点增加药物控制策略等方式减少阳性生长猪水平传播的机率。本研究结果提示，临床上采用黏膜sIgA抗体检测技术对Mhp的感染进行监测时，保育及生长育肥猪群是最理想的检测对象，而鼻拭子样品是最佳的检测样品。

在分子诊断方面，国外用实时定量PCR技术检测了不同感染时间点的鼻拭子、喉拭子、支气管灌洗液和血液样品中的Mhp抗原，喉拭子被证明作为一种微创、高敏感性的临床样本，其具有较高的抗原灵敏度[5]。Moiso等[6]人采用巢式PCR方法检测了3周龄、6周龄、10周龄、16周龄和22周龄猪群的鼻拭子和喉拭子样品，证明喉拭子样品比鼻拭子具有更高的Mhp抗原检测率。然而本次的研究结果显示，在临床条件下猪鼻拭子样品中Mhp抗原的检出率高于喉拭子的检出率，在3种样品中是最高的，这与以往文献报道的结果不一致。对临床样品采集的回溯性调查发现，在大量样品采集的情况下，喉拭子样品的采集具有较大的难度与不确定性，这可能是导致喉拭子样品Mhp检出率下降的主要原因。对于不同生产阶段的猪群，从断奶仔猪到保育猪、育肥猪、屠宰猪、后备猪，鼻拭子样品的抗原阳性率从0逐步提升至100%，随后到种猪有所下降，这与Mhp的感染规律与动力学是一致的[25]。本研究结果提示，临床上用定量PCR方法对Mhp的感染进行活体监测时，考虑样品采集的便利性与稳定性，鼻拭子样品是最理想的检测样品，育肥后期至屠宰阶段以及后备阶段是猪群检出率最高的时期。

根据鼻拭子样品中Mhp黏膜sIgA抗体与抗原的分泌规律来看，断奶仔猪或小日龄猪群、保育猪直至屠宰猪群的Mhp黏膜sIgA抗体检出率要高于抗原检出率，而后备猪群中Mhp抗原检出率要高于Mhp黏膜sIgA抗体的检出率。该研究结果说明，黏膜sIgA抗体转阳要显著早于排毒，但黏膜sIgA抗体在后备猪中持续性较弱。由此可建议，在针对养殖场的Mhp感染率监测时，推荐商品猪群以检测Mhp黏膜sIgA抗体为主，后备和种猪群以检测Mhp抗原为主。

综上，考虑到在实际生产的大群体采样中，喉拭子和咽拭子样本由于受到辅助采样装备缺乏、采集人员的熟练程度、采样时效性及拭子材料不同等因素的影响和限制，可能会带来检测结果的偏差。鼻拭子样品在本研究中被证明可实现不同生产阶段猪群的Mhp黏膜sIgA抗体和抗原通用性检测，同时具有样品易采集、采样简单、样品可靠等优点，同时已形成了标准化的采样操作程序，在实际生产中更具临床可操作性。为了提高检测敏感性与准确度，对于不同生产阶段的猪群应选择性采用抗原或黏膜sIgA抗体的检测手段。