罗哌卡因对人结肠癌顺铂耐药细胞株顺铂敏感性的增强作用及其机制

赵文博，曾炼，胡鹏超，程欣冉，罗辉宇

1 湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院麻醉科，湖北襄阳 441000；2 湖北医药学院基础医学院

结直肠癌（CRC）在我国癌症相关死因中跃居第四位［1］。顺铂是临床上CRC 的一线治疗药物，但随着肿瘤细胞对化疗药物耐药现象的发生，导致CRC患者复发和死亡率居高不下。据统计，Ⅰ期结直肠癌的5 年相对生存率为90%，而发生化疗耐药导致远处转移的Ⅳ期CRC 5 年相对生存率仅为14%［2］。肿瘤耐药的机制至今尚不完全清楚，在诸多耐药机制中细胞内活性氧（ROS）水平被认为与肿瘤细胞的耐药性密切相关。一般情况下癌细胞常表达高水平抗氧化蛋白以清除过量的ROS，避免细胞发生氧化性死亡，进而耐药性增强［3］。因此促进ROS 堆积诱导细胞氧化应激失衡可能成为逆转癌症耐药的新方向。铁死亡为近年新发现的一种细胞死亡形式，是一种铁依赖形式的非凋亡性细胞死亡，由胱氨酸耗尽和大量脂质过氧化控制的膜损伤引起。铁死亡发生后细胞内升高的ROS 水平和线粒体膜电位下降共同导致了肿瘤细胞氧化应激的失衡和抗氧化能力的减弱。由于许多化疗药物如顺铂，主要通过损伤肿瘤细胞DNA 来发挥治疗作用，而耐药肿瘤细胞中抗氧化蛋白表达升高阻碍了顺铂诱导的DNA 损伤，并加速已损伤DNA 修复，最终使肿瘤免于损伤甚至死亡。因此通过诱导细胞发生铁死亡可能成为治疗肿瘤耐药的一种潜在治疗方法。核红细胞2相关因子2（Nrf-2）是一类驱动各种抗氧化剂相关基因表达的蛋白质，主要参与体内的抗氧化作用。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是铁死亡的核心调控蛋白，可清除ROS 等过氧化物来避免细胞受到氧化应激性损伤，当Nrf-2/GPX4 蛋白表达受到抑制时能够诱导铁死亡的发生［4］。溶质载体家族7 成员11（SLC7A11）是铁死亡的抑制因子。Nrf-2、GPX4、SLC7A11 均为铁死亡相关蛋白，在铁死亡的诱导中发挥重要作用。近年，局麻药罗哌卡因可减少全麻用药并缓解外科手术产生的急性疼痛，因而常被用于癌症患者围术期治疗。临床研究［5］表明，罗哌卡因对癌症患者的预后有改善作用。然而，罗哌卡因能否增强CRC 顺铂耐药细胞株对顺铂的敏感性尚不清楚。2020 年3 月—2023 年6 月，我们观察了罗哌卡因对人结肠癌细胞株顺铂敏感性的增强作用，并探讨了其作用机制是否与由Nrf-2、GPX4、SLC7A11 及线粒体膜电位水平降低、ROS 水平升高诱导的铁死亡有关。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂、仪器 人结肠癌LOVO 细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。盐酸罗哌卡因购自宜昌人福药业股份有限公司；顺铂购自江苏豪森药业集团有限公司；胎牛血清购自美国Gibco 公司；RPMI-1640细胞培养液购自美国Gibco公司；胰酶细胞消化液、SDS-PAGE凝胶试剂盒、RIPA细胞裂解液购自中国沈阳万类生物公司；CCK-8 试剂盒、AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒、细胞核染料Hoechst 33258、HRP 标记的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG 购自中国上海碧云天生物科技有限公司；线粒体膜电位检测试剂盒JC-1 和H2DCFDA 绿色荧光探针购自江苏凯基生物技术有限公司；DyLight 488 绿色荧光Ⅱ抗、GAPDH 抗体购自Abcam 公司；MMP-9 抗体购自中国武汉三鹰生物技术有限公司；GPX4 抗体、Nrf-2抗体和SLC7A11 抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司；Fe2+检测试剂盒购自日本Dojind 公司。二氧化碳培养箱（美国Thermo）、生物安全柜（中国力康）、IX70 倒置荧光显微镜（日本Olympus）、多功能荧光酶标仪（美国Molecular Devices）。流式细胞仪（美国BD）、蛋白质免疫印迹电泳槽和转膜槽（美国Bio-rad）、高速冷冻离心机（德国Eppendorf）。

1.2 结肠癌顺铂耐药LOVO/DDP 细胞株的构建及顺铂、罗哌卡因干预浓度的筛选 采用1 μg /mL 的顺铂与进入对数生长期的LOVO 细胞共同培养24 h 后，更换不含顺铂的培养液，待细胞稳定生长后传代，重复上述步骤 5 次后，将顺铂浓度更换为2 μg /mL，继续 重复上 述 操作 5 次，再更 换为5 μg/mL 的顺铂处理细胞 3 次。直至LOVO 细胞株在 5 μg /mL 浓度下稳定生长和传代，将其命名为LOVO/DDP细胞株。

将LOVO 及LOVO/DDP 细 胞 分 别 以1×105个/mL 接种于6 孔板中并加入2 mL /孔RPMI-1640培养液，待细胞贴壁后，置于倒置相差显微镜下观察细胞形态并拍照。光镜下LOVO 细胞呈长梭形，有突起，散在生长；而LOVO/DDP 细胞呈近圆型，少突起，成团生长。采用CCK-8 法检测不同浓度（0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L）顺铂处理以上两种细胞48 h 后，LOVO 细胞中存活率分别为100.00% ± 2.09%、100.66% ± 2.47%、93.15% ±2.21%、37.51% ± 3.33%、13.05% ± 1.47%，LOVO/DDP 细 胞 存 活 率 分 别 为99.50% ± 1.21%、98.79% ± 1.47%、96.62% ± 1.19%、（94.61% ±0.89%）%、（60.51% ± 3.13%）%、（25.47% ± 1.88%。结果表明低浓度顺铂处理结肠癌细胞株48 h后，LOVO 细 胞 株 的 存 活 率 降 低（P<0.01），而LOVO/DDP 细胞株的存活率无明显变化（P>0.05）。随顺铂浓度升高，LOVO 细胞活力明显下降，IC50 为0.927 μmmol/L；在低浓度顺铂作用下，LOVO/DDP 细胞活力下降不明显，在高浓度顺铂处理后细胞活力才下降，IC50为2.493 μmmol/L。上述结果表明，与LOVO/DDP细胞株相比，LOVO 细胞株对顺铂更敏感。结肠癌顺铂耐药细胞株构建成功。选择两种结肠癌细胞株存活率差异最为显著的顺铂干预浓度1.0 μmol/L 作为后续实验所用顺铂的浓度。

将LOVO 及LOVO/DDP 细 胞 分 别 以1×105个/mL 接种于6 孔板中并加入2 mL /孔RPMI-1640培养液，待细胞贴壁后加入0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L 罗哌卡因处理以上两种细胞48 h 后，采用CCK-8 法检测不同浓度罗哌卡因作用后LOVO及LOVO/DDP 细胞株存活率。结果LOVO 细胞株中存活率分别为100.00% ± 1.25%、98.57% ± 2.08%、97.47% ± 1.59%、92.24% ± 3.69%、63.41% ±3.44%、33.18% ± 0.92%，LOVO/DDP细胞存活率分别为100.00% ± 2.36%、99.75% ± 6.83%、95.46% ±4.14%、90.27% ± 4.60%、76.93% ± 1.66%、45.70% ±5.68%。结果显示低浓度的罗哌卡因处理 LOVO 细胞和 LOVO/DDP 细胞株，细胞株活力无明显变化（P>0.05），仅罗哌卡因浓度大于 1.0 mmol/L 时，两种结肠癌细胞株活力发生下降，呈剂量依赖性。CCK-8 实验结果表明低浓度罗哌卡因对 LOVO 细胞和 LOVO/DDP 细胞存活率无明显影响。与单独顺铂1.0 μmmol/L 作用相比，1 mmol/L 罗哌卡因联合1.0 μmmol/L 顺铂作用后 LOVO/DDP 细胞存活率由94.61% ± 0.89%下降为62.95% ± 5.85%，差异有统计学意义（P<0.01）。由于1 mmol/L 以上浓度的罗哌卡因对细胞毒性较强易掩盖罗哌卡因的增敏作用，因此我们选择 1 mmol/L的罗哌卡因用于后续实验。

1.3 LOVO 和 LOVO/DDP 细胞株分组及罗哌卡因干预 将LOVO 和LOVO/DDP 两种细胞分别设立4个组别，分别为罗哌卡因组 + 顺铂组、罗哌卡因组、顺铂组、对照组。对照组加入细胞培养液培养；罗哌卡因组加入细胞培养液和1 mmol/L 浓度罗哌卡因培养；顺铂组加入细胞培养液和1.0 μmol/L 浓度顺铂培养；罗哌卡因联合顺铂组加入细胞培养液后再同时加入1.0 μmol/L 浓度顺铂及1 mmol/L 浓度罗哌卡因培养。

1.4 各组增殖、迁移能力的观察 采用平板克隆实验观察细胞株增殖能力。取上述各组细胞株，均匀接种于6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2的细胞孵育箱中。培养14 d 后，用4%多聚甲醛固定15 min，洗涤2 次，用0.1%结晶紫染色15 min 后洗涤多余染料，观察细胞株克隆形成数并拍照。

采用Transwell实验观察细胞株迁移情况：取上述各组细胞株，接种于含无血清培养基的Transwell的上室中，并在下室中加入600 μL含 10% FBS的培养基，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，培养48 h 后，用 4%多聚甲醛固定细胞，再用 0.1% 结晶紫染色30 min，用PBS洗 3 遍。在显微镜下观察细胞迁移情况。

采用Western blotting 法检测细胞迁移蛋白MMP-9。取上述各组细胞，通过裂解液破碎离心加热提取蛋白质样品，然后上样。 电泳、转膜、封闭、孵育一抗（MMP-9，1∶2 000） 4 ℃ 过夜。次日洗膜3次后，加HRP 标记的二抗（山羊抗兔IgG，1∶2 000）室温孵育120 min，加入超特敏ECL 进行显色，采用Image J软件测定条带灰度值进行分析。

1.5 各组细胞凋亡情况观察 采用流式细胞术。取上述各组细胞，按常规操作步骤上流式细胞仪检测。凋亡率（%）=凋亡细胞/细胞总数 ×100%。

1.6 各组细胞线粒体膜电位的观察、ROS及亚铁离子的检测 采用JC-1线粒体膜电位染色法。取上述各组细胞，吸走培养液，PBS洗涤细胞。加入线粒体膜电位试剂盒中JC-1 工作液，置于培养箱孵育30 min后，用PBS再次清洗细胞2遍，用4%多聚甲醛固定细胞。再用Hoechst 33258 标定细胞核，置于荧光显微镜下拍照，观察荧光强度，并计算JC-1多聚体红色荧光与单体绿色荧光的比值 ［JC-1（Red/Green）］。

采用荧光染色法测定ROS。取上述各组细胞在培养箱37 ℃条件下孵育 30 min，用PBS 洗涤细胞2遍，再用4%多聚甲醛固定15 min 后加入H2DCFDA绿色荧光探针10 min，随后使用无血清培养液洗涤细胞2遍，再次使用Hoechst 33258标记细胞核，避光染色5 min。置于荧光显微镜下拍照，观察荧光强度，并计算相对荧光强度。采用免疫荧光法检测亚铁离子，最后置于荧光显微镜下观察和拍照。

1.7 各组铁死亡相关蛋白Nrf-2、GPX4、SLC7A11的检测 取上述各组细胞，按Western blotting 试剂盒操作步骤操作检测Nrf-2、、GPX4、SLC7A11 蛋白，结果以灰度值表示。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism 8进行制图和统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组增殖、迁移能力及凋亡情况 LOVO 细胞中，与对照组比较，顺铂组LOVO 细胞株形成的克隆体数明显减少，罗哌卡因组克隆体形成数无差异，顺铂联合罗哌卡因组细胞株克隆体数减少；与顺铂组比较，顺铂联合罗哌卡因组细胞株克隆体数进一步下降。在LOVO/DDP 细胞株中，与对照组比较，顺铂组、罗哌卡因组细胞株克隆体数目下降不明显，顺铂联合罗哌卡因组细胞株克隆体形成数减少；与顺铂组比较，顺铂联合罗哌卡因组细胞株克隆体数明显减少（图1）。

图1 罗哌卡因、顺铂单独及联合干预后LOVO及LOVO/DDP细胞株克隆体

LOVO细胞株和LOVO/DDP细胞株中，与对照组相比，顺铂组和罗哌卡因组迁移细胞株数目均减少，罗哌卡因联合顺铂组迁移细胞株数减少；与顺铂组比较，罗哌卡因联合顺铂组迁移细胞株数减少（见图2）。

图2 罗哌卡因、顺铂及联合用药后迁移的LOVO与LOVO/DDP细胞株

LOVO 细胞株中，罗哌卡因组 + 顺铂组、罗哌卡因组、顺铂组、对照组MMP-9 蛋白水平分别为0.55 ± 0.13、1.08 ± 0.09、0.75 ± 0.08、1.34 ±0.07，与对照组比较，顺铂组MMP-9 蛋白水平降低（t=5.67，P<0.05），罗哌卡因组差异无统计学意义；与顺铂组比较，罗哌卡因组 + 顺铂组MMP-9 蛋白差异无统计学意义（P>0.05）。LOVO/DDP 细胞株中，罗哌卡因组 + 顺铂组、罗哌卡因组、顺铂组、对照组MMP-9 蛋白水平分别为0.34 ± 0.04、0.88 ± 0.01、0.60 ± 0.01、1.30 ± 0.05，与对照组比较，顺铂组、罗哌卡因组MMP-9 蛋白水平差异无统计学意义；与顺铂组比较，罗哌卡因组 + 顺铂组MMP-9 蛋白水平降低（t=4.43，P<0.05）。

LOVO 细胞株中，与对照组细胞株比较，顺铂组凋亡细胞率升高、存活率下降，罗哌卡因组细胞凋亡率、存活率差异无统计学意义，罗哌卡因联合顺铂组细胞凋亡率升高、存活率下降（t=18.49，P<0.01）；与顺铂组比较，罗哌卡因联合顺铂组细胞凋亡率升高、存活率下降（t=10.95，P<0.01）。LOVO/DDP 细胞株中，与对照组相比，顺铂组、罗哌卡因组细胞凋亡率差异无统计学意义；与顺铂组、罗哌卡因组比较，顺铂联合罗哌卡因组细胞凋亡率升高（t=18.29，P<0.01），见表1。

表1 LOVO和LOVO/DDP中各组细胞存活率、细胞凋亡率（%， ± s）。

表1 LOVO和LOVO/DDP中各组细胞存活率、细胞凋亡率（%， ± s）。

组别LOVO细胞株细胞存活率细胞凋亡率罗哌卡因 + 顺铂组罗哌卡因组顺铂组53.42 ± 2.86 12.46 ± 3.63 29.69 ± 1.92对照组LOVO/DDP细胞株40.97 ± 4.05 89.03 ± 0.32 68.63 ± 2.56 93.67 ± 0.78 5.81 ± 0.82罗哌卡因 + 顺铂组26.07 ± 1.30罗哌卡因组顺铂组7.58 ± 0.69 12.81 ± 0.73对照组71.34 ± 1.03 91.21 ± 0.42 85.68 ± 0.57 93.16 ± 1.35 6.28 ± 1.38

2.2 LOVO 细胞株及LOVO/DDP 细胞株中各组线粒体膜电位、ROS 及亚铁离子水平比较 在LOVO细胞株和LOVO/DDP 细胞株中，与对照组比较，罗哌卡因组、顺铂组及罗哌卡因联合顺铂组JC-1 多聚体红色荧光与单体绿色荧光的比值［JC-1（Red/Green）］均降低，并且以罗哌卡因联合顺铂组下降最为显著（t分别为64.77、9.98，P均<0.01），见表2。

表2 LOVO细胞株及LOVO/DDP细胞株中各组线粒体膜电位、ROS及亚铁离子水平

在LOVO 细胞株和LOVO/DDP 细胞株中，与对照组比较，罗哌卡因组、顺铂组及罗哌卡因联合顺铂组ROS 水平升高，以罗哌卡因联合顺铂组为著（t分别为37.13、59.53，P<0.01），见表2。

亚铁离子染色结果显示，在LOVO细胞株和LOVO/DDP细胞株中，与对照组相比，罗哌卡因组、顺铂组、罗哌卡因联合顺铂组Fe2+荧光强度均增强，且以罗哌卡因联合顺铂组增强最为显著（P<0.01），见表2。

2.3 LOVO 细胞株及LOVO/DDP 细胞株中铁死亡相关蛋白Nrf-2、GPX4、SLC7A11水平比较 在LOVO细胞株中，与对照组相比，罗哌卡因组、顺铂组、罗哌卡因联合顺铂组Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋白水平均下降（tNrf-2分别为4.63、11.84、26.82，tGPX4分别为4.11、12.28、14.78，tSLC7A11分 别 为7.24、8.70、14.78， P均<0.01）；与顺铂组相比，罗哌卡因联合顺铂组Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋白水平降低（t分别为8.54、3.17、6.14，P均<0.01）。在LOVO/DDP细胞株中，与对照组相比，顺铂组GPX4 蛋白下降（t=8.58，P<0.01）、罗哌卡因组GPX4 蛋白下降（t=3.28，P<0.05），顺铂组及罗哌卡因组Nrf-2、SLC7A11 蛋白表达水平下降（tNrf-2分别为12.08、8.49，tLSLC7A11分别为5.57、4.49，P均<0.01），罗哌卡因联合顺铂组Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋白水平均下降（t分别为25.33、11.37、11.26，P<0.01）；与顺铂组相比，罗哌卡因联合顺铂组细胞株中Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋 白 水 平 下 降（t分 别 为9.73、7.56、7.17，P均<0.01），见表3、图3。

表3 LOVO和LOVO/DDP细胞株中各组GPX4、Nrf-2、SLC7A11蛋白水平（ ± s）

表3 LOVO和LOVO/DDP细胞株中各组GPX4、Nrf-2、SLC7A11蛋白水平（ ± s）

组别LOVO细胞株Nrf-2蛋白GPX4蛋白SLC7A11蛋白罗哌卡因 + 顺铂组罗哌卡因组顺铂组对照组LOVO/DDP细胞株0.17 ± 0.03 0.75 ± 0.06 0.49 ± 0.05 0.97 ± 0.03 0.33 ± 0.04 0.76 ± 0.02 0.51 ± 0.02 0.89 ± 0.04 0.71 ± 0.03 1.04 ± 0.04 0.87 ± 0.06 1.40 ± 0.06罗哌卡因 + 顺铂组罗哌卡因组顺铂组对照组0.51 ± 0.04 1.14 ± 0.03 0.93 ± 0.05 1.44 ± 0.04 0.34 ± 0.07 1.07 ± 0.08 0.70 ± 0.02 1.39 ± 0.11 0.63 ± 0.06 1.10 ± 0.01 1.01 ± 0.04 1.28 ± 0.06

图3 LOVO和LOVO/DDP细胞株Nrf-2、SLC7A11及GPX4表达的Western blotting电泳图

3 讨论

CRC 是常见的胃肠道恶性肿瘤，此病好发于40岁以上中老年人，男性多于女性。CRC 早期常无明显临床表现或仅有排便习惯和粪便性状的改变，因此难以及时发现。当患者出现全身明显症状时常已到晚期，预后很差［6］。尽管目前治疗方案多样，但顺铂仍是CRC 患者重要的治疗药物，顺铂在治疗初期能够有效抑制肿瘤细胞增殖和转移并促进细胞凋亡，但是随着其广泛使用，CRC 逐渐产生对顺铂的耐药性［7］。因此解决CRC的顺铂耐药性成为亟待解决的科研问题。

近年，越来越多研究证实，局麻药可直接或间接影响肿瘤的进展。体外和体内实验发现，局麻药可抑制肿瘤复发，目前认为这种效应是多种因素共同调节的结果［8-9］。研究表明，局麻药罗哌卡因可以通过调节Ras 和RhoA 信号通路、整合素ITGα2 和ITGβ1、Wnt/β-连环蛋白、血管内皮生长因子（VEGF）、细胞凋亡相关途径和细胞周期停滞、细胞外信号调节激酶ERK、非编码RNA、Na+通道、脱氧核糖核酸去甲基化、NF-κB 途径、MMP-9、PI3K/AKT 途径及JNK 途径发挥抗肿瘤作用，并且大多数与肿瘤的化疗敏感性有关［10］。虽然罗哌卡因在肿瘤治疗中直接增敏作用的相关研究十分缺乏，但是已有研究表明同样属于酰胺类麻醉药的利多卡因和布比卡因这两种可局麻药能够通过抑制细胞内RASSF1A 甲基化水平，使RASSF1A 表达增加，进而增强顺铂对肝癌HepG2 和BEL-7402细胞的毒性作用［11］。根据以上研究，我们推测罗哌卡因具有增强肿瘤化疗敏感性的潜能。研究［12］报道，罗哌卡因可以促进细胞内ROS 的生成增多，从而促进细胞铁死亡发生。因此罗哌卡因与细胞铁死亡的发生是否存在联系以及在肿瘤治疗中是否具有药效关系值得研究。

本研究通过体外建立的人结肠癌顺铂耐药LOVO/DDP 细胞株不仅形态上与LOVO 细胞株存在明显差异，而且显著减弱了顺铂的细胞毒作用，说明发生顺铂耐药的 LOVO/DDP 细胞株与顺铂敏感的LOVO 细胞株相比，改变显著且耐药特性突出。本研究中CCK-8 实验发现，罗哌卡因单独处理时1 mmol/L 及以下浓度时对两种结肠癌细胞株均无明显细胞毒作用，仅当浓度超过1 mmol/L 时可直接损失肿瘤细胞，说明低浓度罗哌卡因对结肠癌细胞株无直接治疗效果；而与之前单独顺铂处理相比，1 mmol/L 罗哌卡因联合1 μmol/L 顺铂处理两种结肠癌细胞株后，LOVO 细胞株存活率进一步下降；LOVO/DDP 细胞株在1 μmol/L 顺铂处理后存活率无明显改变，1 mmol/L 罗哌卡因联合1 μmol/L 顺铂处理后，细胞存活率发生明显下降。通过以上结果并结合文献报道中罗哌卡因在肿瘤治疗中的作用，我们认为低浓度罗哌卡因虽无直接的细胞毒性作用，但其可能具有潜在的对化疗药物的增敏作用。通过平板克隆实验、Transwell 实验、MMP-9 表达检测和流式细胞术的实验结果，我们发现顺铂联合罗哌卡因增强了对结肠癌细胞株尤其是LOVO/DDP 细胞株增殖和迁移的抑制及促凋亡作用。这说明罗哌卡因或许能成为一种肿瘤治疗中的辅助药物或增敏剂。罗哌卡因对顺铂具有增敏作用，但其作用机制仍尚不清楚。

铁死亡是近年新发现的细胞死亡方式。已有研究［13-14］证实，铁死亡的发生能够增强已耐药肿瘤细胞对顺铂、多柔比星及紫杉醇等多种抗癌药物的敏感性。目前认为，铁死亡能够增强其他常规抗癌治疗的敏感性是由于其通过调控GPX4、SLC7A11、Nrf-2 等蛋白表达水平加速了细胞内谷胱甘肽的耗竭和ROS 的堆积，从而导致细胞处于氧化应激性失衡的敏感状态，进而在遇到其他化疗药物后更易于死亡。然而，到目前为止铁死亡在癌症化疗敏感性方面的研究仍有限，需要更多研究加以补充。

有研究［15］发现，罗哌卡因可以诱导线粒体裂变蛋白DRP1，产生ROS 并引起线粒体功能障碍，包括线粒体膜电位降低、细胞色素C 氧化酶活性增强和ATP 产生。因此罗哌卡因是否也通过此机制即线粒体的改变及ROS 的产生增多，在肿瘤治疗中发挥了增敏作用需要进一步验证。本研究结果发现与文献报道结果类似，罗哌卡因处理后两种结肠癌细胞株内线粒体膜电位均发生了下降且细胞内ROS 水平及亚铁离子明显增多，罗哌卡因联合顺铂组最为明显。而线粒体形态和功能的改变、ROS 的积累及亚铁离子增多已被证实是铁死亡发生的标志，降低的线粒体膜电位和细胞内增多的ROS，为人结肠癌细胞株铁死亡发生创造了有利条件。

Nrf-2 是一种转录因子，与kelch 样ECH 关联蛋白1（Keap1）和抗氧化反应元件（Are）一起，调节抗氧化蛋白的表达，保护细胞免受由ROS 引起的应激性损伤［16］。当细胞内ROS 水平升高， Keap1-Nrf-2 复合体分解而抑制Nrf-2 泛素化，然后Nrf-2 转位到细胞核并与Are 结合，诱导抗氧化蛋白的表达。在CRC 的耐药机制中，GPX4 的过度表达会导致化疗药物效果下降，最终诱导癌细胞耐药的发生。此外，细胞内高表达的GPX4 还可通过调节ROS 水平来影响肿瘤上皮—间充质转化，与患者预后不佳密切相关［17］。GPX4 表达或功能的下降可增强化疗药物对氧化应激诱导的细胞死亡的易感性［18-20］。已有研究证实，抑制Nrf-2 的表达能够增强CRC 细胞和肝癌细胞等对顺铂、阿霉素、索拉非尼的敏感性［21-23］。SLC7A11不仅是铁死亡的有效靶标，在多种肿瘤耐药的治疗中，SLC7A11 也扮演重要的角色，包括肺腺癌、胃癌、结直肠癌、胶质瘤等等。我们对铁死亡核心调控蛋白表达水平进行了测定，结果发现罗哌卡因联合顺铂显著抑制了Nrf-2、GPX4 及SLC7A11 的表达。以上结果提示罗哌卡因与顺铂联合用药可能是通过调控Nrf-2、GPX4 及SLC7A11 蛋白，降低线粒体膜电位及促进ROS 积累，诱导细胞发生铁死亡，从而增强人结肠癌顺铂耐药细胞株的顺铂敏感性。

总之，罗哌卡因可增强人结肠癌顺铂耐药细胞株顺铂敏感性，其作用机制可能与由 Nrf-2、GPX4、SLC7A11 及线粒体膜电位水平降低、ROS水平升高诱导的铁死亡有关。然而，目前我们的研究局限于体外实验，对罗哌卡因诱导铁死亡在肿瘤耐药过程中的作用机制了解仍十分有限，还需进一步的体内实验和临床观察进行多方面验证。