PLGA-姜黄素纳米颗粒的制备及体外抗炎性能评价

李 真， 郝 凯， 贺超良， 田华雨，4

（1. 中国科学院长春应用化学研究所生态环境高分子材料重点实验室, 长春 130022;2. 中国科学技术大学应用化学与工程学院, 合肥 230026;3. 厦门大学化学化工学院, 固体表面物理化学国家重点实验室, 厦门 361005;4. 福建省能源材料科学与技术创新实验室(IKKEM), 厦门 361005）

姜黄素（Cur）是一种在姜科植物中含量较高的多酚类物质， 是姜黄的主要成分［1］. 姜黄素的来源广泛， 不良反应小， 价格低廉［2］， 且经研究证实其具有多种药理作用， 包括对肿瘤的抑制作用、 抗氧化作用、 抗炎作用和免疫调节作用［3］. 姜黄素可通过调节核转录因子-κB（NF-κB）信号通路抑制氧化反应，阻碍炎症细胞因子、 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的分泌， 从而发挥抗炎作用［4，5］. 但因其亲脂性强［6］、 水溶性和稳定性差， 难以被细胞摄取和吸收， 不利于药物发挥作用， 从而极大地限制了其生物利用［7］. 目前， 一些以脂质体、 微球和聚合物胶束为载体的新型姜黄素制剂已被开发， 用于提高其分散性和稳定性［8］. 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种生物相容性良好的材料， 已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床治疗［9］. PLGA具有良好的药物包封效果和优良的成膜性能， 在药物递送领域获得了广泛的应用. 研究结果表明， PLGA可将药物分子封装在其形成的纳米颗粒中， 在保留药物活性的同时能够起到药物缓释的效果［10～13］.

本文通过双乳液法制备了一种具有较高Cur载药率的PLGA@Cur纳米颗粒（PLGA@Cur NPs）， 显著改善了Cur在水中的分散性和水溶性， 并对其抗氧化性和抗炎性进行了详细的表征. 结果表明， 在细胞水平上， PLGA@Cur NPs可有效清除细胞内的活性氧（ROS）， 降低促炎细胞因子含量， 缓解细胞水平的炎症. 该纳米药物递送系统的开发为Cur用于炎症疾病的治疗奠定了基础， 为提高姜黄素的生物利用度提供了新的思路.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

PLGA（货号P133293）、 姜黄素（货号C400222）、 聚乙烯醇（PVA， 货号P139537）、 黄嘌呤氧化酶、黄嘌呤、 二氢乙锭和2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（AAPH）， 分析纯， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 二氯甲烷、 无水乙醇和过氧化氢， 分析纯， 上海沪试实验室器材股份有限公司； 无水硫酸铜， 分析纯， 北京伊诺凯科技有限公司； 甲醇（HPLC级）和3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB， 分析纯）， 北京百灵威科技有限公司； 冰乙酸（HPLC级）和叔丁基过氧化氢溶液（TBHP， 分析纯）， 上海麦克林生化科技有限公司； RAW 264.7， 美国ATCC公司； 胎牛血清、 磷酸盐缓冲液（PBS）和细胞培养基（DMEM），美国Gibco 公司； 活性氧测定试剂盒， 上海碧云天生物技术有限公司； TNF-αELISA 试剂盒， 美国Thermo Fisher Scientific 公司； CCK-8测定试剂盒， 大连美伦生物技术有限公司； CpG核酸， 上海生工生物工程有限公司， 其意义链序列为TCGTCGTTTCGGCGCGCCGCCCACAUAAAAAACAGUUG.

UltiMate3000型超高效液相色谱仪（HPLC）， 美国戴安公司； Zeiss GeminiSEM 500型场发射扫描电子显微镜（SEM）， 美国蔡司公司； H1750R 型高速离心机， 湖南湘仪离心机仪器有限公司；SB-5200DTDN型超声波细胞破碎机， 宁波新芝生物科技股份有限公司； RO15型多点磁力搅拌器， 德国IKA 公司； LAMBDA 1050+型紫外-可见-近红外分光光度计（UV-Vis-NIR）， 美国PerkinElmer 公司；Varioskan LUX 型酶标仪， 美国Thermo Fisher Scientific 公司； NanoBrook 173Plus 型动态光散射粒度仪（DLS）， 美国Brookhaven公司.

1.2 实验过程

1.2.1 PLGA@Cur NPs 的制备 采用双乳液法制备PLGA@Cur NPs. 将50 mg PLGA 和一定质量的Cur 溶解在1 mL 二氯甲烷中形成混合溶液， 然后缓慢加入至3 mL 5%（质量分数）PVA 水溶液中， 用100 W 超声波破碎仪超声1 min， 得到初始乳液. 将该乳液缓慢加入至50 mL 1%（质量分数）PVA 水溶液中， 用100 W超声波破碎仪超声3 min， 得到复乳液. 通过在室温下搅拌12 h除去复乳液中残留的二氯甲烷. 然后用离心机以1200 r/min 的速度离心10 min， 分离得到PLGA@Cur NPs. 用15 mL超纯水洗涤PLGA@Cur NPs 3次进行纯化.

1.2.2 PLGA@Cur NPs的表征 将PLGA@Cur NPs分散在超纯水中， 配制成约500 μg/mL的悬浊液， 采用动态光散射粒度仪（DLS）对纳米颗粒的粒径、 多分散指数（PDI）和Zeta电位进行测定［14，15］. 通过扫描电子显微镜观察纳米颗粒的形貌.

1.2.3 PLGA@Cur NPs 包封率和载药率的测定 采用双乳液法制备PLGA@Cur NPs 色谱柱：Agilent Extend-C8 4.6×250 mm， 流动相为甲醇-0.5%乙酸水溶液（体积比4∶1）， 柱温35 ℃， 流速1.0 mL/min， 检测波长425 nm， 进样量10 μL.

Cur 标准曲线的绘制： 将1 mg 姜黄素溶于1 mL 甲醇中， 用流动相梯度稀释为500， 250， 125，62.5， 31.25， 17.82， 3.91和1.95 μg/mL的姜黄素标准溶液， 进行HPLC测试， 记录峰面积， 绘制标准曲线.

精确称取适量冻干后的PLGA@Cur NPs， 加入一定量的乙醇， 超声20 min， 使姜黄素充分提取至乙醇中， 取上清液经过滤后用于HPLC检测. 按下式计算姜黄素的包封率（DLE， %）和载药量（DLC， %）：

式中：m（Lg）为实际装载姜黄素的质量；m（Fg）为理论投入姜黄素的质量；mN（g）为载药纳米颗粒的质量.

1.2.4 PLGA@Cur NPs的抗氧化性测试 通过硫酸铜与H2O2的芬顿（Fenton）反应制得·OH. 首先将0.1 mL Cu2（+500 μg/mL）、 0.1 mL H2O（21 mmol/L）、 0.1 mL TMB（10 mmol/L）和0.1 mL 样品（2 mg/mL）加入到0.6 mL Milli-Q水中， 室温孵育1 h， 测定氧化后TMB在混合物中的UV-Vis吸光度值. 通过观察样品在650 nm处的峰值的变化考察其对·OH的清除作用. 黄嘌呤可在黄嘌呤氧化酶的作用下产生. 将0.1 mL 黄嘌呤氧化酶（5 EU/mL）、 0.1 mL 黄嘌呤（6 mmol/L）和0.1 mL PLGA@Cur NPs（2 mg/mL， 样品组）或0.1 mL Milli-Q 水（空白组）混合在0.6 mL PBS 中， 于37 ℃孵育40 min. 然后加入0.1 mL 二氢乙锭（1 mg/mL）， 混合均匀后， 转移至荧光酶标板中， 用酶标仪测定二氢乙锭氧化产物乙锭的荧光强度.的相对含量（Content of O·2-， %）按下式计算：

其中：Fs和Fb分别为处理后的样品组和空白组的荧光强度.

1.2.5 PLGA@Cur NPs 的细胞毒性测试 使用CCK-8 试剂盒评价PLGA@Cur 的细胞毒性. 将RAW 264.7 细胞在含10%的胎牛血清及100 U/mL 青霉素、 100 U/mL 链霉素的DMEM 高糖培养液中进行培养， 培养箱培养条件设定为5%（体积分数）CO2， 37 ℃. 当RAW 264.7 细胞生长到一定数量时， 以1×104cell/孔的密度接种到96 孔板中， 并在37 ℃、 含5% CO2的培养箱中黏附12 h［16～18］. 然后用不同浓度的样品处理这些细胞. 在培养24 h后， 将培养基替换为含有10% CCK-8的生长培养基， 培养1 h. 用酶标仪测量孔板中溶液在450 nm处的光强度（OD 450 nm）计算细胞活力.

1.2.6 PLGA@Cur NPs 的血液相容性测试 取1 mL新鲜小鼠血液， 以1200 r/min 的转速离心10 min分离血细胞. 用PBS洗涤离心沉淀物， 直至上清液澄清透明， 离心沉淀物为血细胞. 阳性组加入10 μL血细胞和90 μL 1% TritonX-100， 阴性组加入10 μL血细胞和90 μL PBS. 在样品组中， 加入10 μL血细胞和90 μL PLGA@Cur， 使PLGA@Cur NPs 的终浓度为100 mg/mL. 各组于室温下孵育2 h， 离心后拍照.取离心后的上清液， 测定其在450 nm处的吸光度值. 按下式计算溶血率（Hemolysis， %）：

其中：As，Ap和An分别为样本组、 阳性组和阴性组的吸光度值.

1.2.7 细胞内ROS 检测 将RAW 264.7 细胞以8000 cell/孔的密度接种到96 孔板中， 并在37 ℃、 含5% CO2的培养箱中黏附12 h. 用10 μL 1 mmol/L的TBHP和10 μL 1.2 mg/mL的PLGA@Cur NPs 处理细胞24 h， 细胞用H2DCFDA染色后用PBS反复冲洗， 用荧光显微镜成像.

1.2.8 细胞因子检测 将RAW 264.7 细胞以2×104cell/孔的密度接种于96 孔板中. 将10 μL 20 μg/mL 的CpG 和12.5/15/20 μL 2 mg/mL 的PLGA@Cur NPs 加入至96 孔板中. 在37 ℃、 含5% CO2的培养箱中孵育24 h后， 用TNF-αELISA试剂盒评估培养基中TNF-α的含量.

2 结果与讨论

2.1 PLGA@Cur NPs的制备

以PLGA 和Cur 的二氯甲烷溶液为油相， PVA 水溶液为水相， 通过双乳液溶剂挥发法制备了PLGA@Cur NPs［19～21］（Scheme 1）. 通过控制Cur与PLGA的质量比分别为1∶25， 1∶10， 1∶5， 3∶10和2∶5，得到PLGA@Cur 1～PLGA@Cur 5， 其中PLGA的质量是固定的， 改变Cur的质量. 通过SEM观察了所制备的纳米颗粒（图1）， 其形态呈均一的球形， 表面光滑， 粒径大小一致. 经动态光散射粒度仪（DLS）测定了载药纳米颗粒的Zeta电位、 粒径和PDI， 结果列于表1. 与PLGA纳米颗粒相比， PLGA@Cur NPs负电性增加； PLGA@Cur NPs保留了PLGA纳米颗粒的尺寸， 其水动力学尺寸约为300 nm， 与SEM结果相符； PLGA@Cur NPs的PDI＜0.3， 具有良好的单分散性.

Scheme 1 Schematic for the preparation of PLGA@Cur NPs

Fig.1 SEM images of PLGA(A) and PLGA@Cur1—PLGA@Cur-5(B—F) nanoparticles

Table 1 Characteristics of different nanoparticles

2.2 包封率和载药率

通过HPLC方法［22，23］测定了所制备的系列载药纳米颗粒的Cur负载率. 由表2可见， 随着Cur含量的增加， PLGA@Cur NPs 中Cur 的DLE 增加， DLC 先增加后减少. 当Cur 与PLGA 的质量比为1∶5 时（PLGA@Cur 3）， 纳米颗粒的载药率高于其它体系. 当加入的Cur过多时， 药物无法被载体包埋， 容易造成药物的损失， 使载药率下降. 当Cur与PLGA的质量比为2∶5时， 在SEM图像中观察到有姜黄素颗粒的出现， 此时载体的负载能力达到上限， 继续增加药物与载体的投料比也无法得到更高载药量的纳米颗粒. 基于药物的包封率和载药率的测定结果， 优选PLGA@Cur 3（Cur与PLGA的质量比为1∶5， 包封率为15.09%， 载药率为34.85%）用于后续的实验.

Table 2 DLE and DLC of PLGA@Cur 1—PLGA@Cur 5 nanoparticles

2.3 PLGA@Cur NPs的稳定性

纳米颗粒的稳定性对于药物的储存和运输至关重要， 通过测定纳米颗粒在PBS中的粒径变化考察了所制备PLGA@Cur NPs 的稳定性. 由图2 可见， 所制备的PLGA@Cur NPs 呈淡黄色， 均匀分散在水中. 室温下放置7 d后， PLGA@Cur NPs溶液未发生明显变化， 而经过超声分散的Cur在静置1 h后就出现了聚集， 并且下沉到样品瓶底部. DLS结果（图3）也证实PLGA@Cur NPs保留了PLGA纳米颗粒的稳定性， 粒径在7 d内没有显著变化.

Fig.2 Appearance of Cur and PLGA@Cur NPs solutions placed at different time points at room temperature

Fig.3 Hydrodynamic size of PLGA, Cur and PLGA@Cur NPs to explore the stability

2.4 PLGA@Cur NPs的抗氧化性

首先， 利用H2O2和Cu2+之间的芬顿作用产生了·OH［24，25］， 当·OH 存在时可氧化·OH 的检测探针TMB生成在652 nm处有吸收峰的oxTMB（图4）. 当H2O（2H）， TMB（T）和Cu2+同时存在时， 652 nm处出现了明显的吸收峰. 加入PLGA@Cur NPs 后吸收峰消失， 而Cur的存在并未减少溶液中的·OH. 此外，利用黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶的氧化作用产生， 通过测量检测探针二氢乙锭氧化产物氢乙锭的荧光强度［26，27］测定了PLGA@Cur NPs 对于O·2-的清除效率（图5）. 将对照组（加入等体积的PBS）的荧光强度值定义为含量100%. 随着PLGA@Cur NPs 和Cur 浓度的增加， 溶液中的O·2-含量减少. 当PLGA@Cur NPs 浓度为200 μg/mL 时， 可以去除超过70%的， 且其清除效率强于Cur. 我们推测PLGA@Cur NPs清除·OH和的效率强于Cur的原因在于， PLGA@Cur NPs的分散性较好， 可更充分地发挥其抗氧化性， 清除溶液中的活性氧.

Fig.4 ·OH scavenging capability after different treatments

Fig.5 O·2- scavenging capability after different treatments

2.5 PLGA@Cur NPs的生物相容性

为了在细胞水平验证PLGA@Cur NPs 的性能， 首先通过CCK-8 检测了PLGA@Cur NPs 对RAW 264.7 巨噬细胞的细胞毒性. 测试结果显示（图6）， 当浓度高达200 μg/mL 时， PLGA， Cur 和PLGA@Cur NPs 均不会对细胞的增殖产生影响. 此外， 还测试了PLGA@Cur NPs 的溶血性能（图7）. 与阳性对照组相比， PLGA@Cur NPs并未出现溶血现象， 表明其具有良好的细胞相容性.

Fig.7 Hemolysis analysis of red blood cells(RBCs)

2.6 PLGA@Cur NPs在细胞水平的抗氧化性能和抗炎性能

验证了材料的细胞毒性后， 使用TBHP 预处理RAW 264.7 细胞， 诱导细胞产生ROS［28］， 然后用PLGA@Cur NPs 处理， 以2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）为探针评估细胞内ROS 水平. 在TBHP的刺激下， 细胞中观察到亮绿色的荧光， 表明ROS的产生（图8）. 相反， PLGA@Cur NPs处理导致细胞内荧光强度明显下降， 而Cur 处理后细胞内荧光强度下降不明显. 为验证PLGA@Cur NPs 的抗炎性能， 使用免疫刺激剂CpG刺激RAW 264.7（图9）. PLGA@Cur NPs 保留了Cur的抗炎性能， 使细胞中的炎症因子TNF-α恢复正常. 这些结果表明， PLGA@Cur NPs可在体外清除细胞内ROS， 缓解细胞水平的炎症.

Fig.8 Intracellular ROS imaging of macrophages after different treatments

Fig.9 TNF-α cytokine generated by macrophages after different treatments for 24 h

3 结 论

通过双乳液溶剂挥发法成功制备了包载Cur的PLGA纳米颗粒PLGA@Cur NPs. 经测定， 所生成的PLGA@Cur3水动力学尺寸为340 nm， 包封率为15.09%， 载药率为34.85%. 该纳米颗粒具有良好的分散性和稳定性， 在水溶液中可稳定存在7 d. 此外， PLGA@Cur NPs还可以有效清除·OH和O·2-两种活性氧， 且清除效果强于Cur. PLGA@Cur NPs 具有良好的生物相容性， 能有效清除细胞内ROS， 具有良好的抗炎性能， 可缓解细胞水平的炎症. 可见， PLGA@Cur NPs 是一种具有优异抗氧化性和抗炎性能的药物递送系统， 其作为一种生物安全性材料有望应用于炎症疾病的治疗.