刺葡萄与欧美杂交种葡萄“夏黑”幼叶花色苷比较分析

陶慧慧,付鹏鸿,陈 钱,王斯妤,张 萌,杨思潮,胡新龙

(1 江西省农业科学院园艺研究所,南昌,330200;2 江西省抚州市南城县农业科学技术研究中心,江西抚州,347000 )

花青素(又叫花色素)是具有3-羟基色原烯结构的黄酮类化合物,是苯丙氨酸代谢途径中产生的重要代谢产物,赋予植物器官组织从桔红色到蓝紫色等不同色泽,并在植物应对紫外线损伤、抗逆胁迫及吸引昆虫授粉等方面扮演重要作用[1-3]。常见花色素可分为6类:天竺葵素(Pelargonidin,Pg)、矢车菊色素(Cyamdin,Cy)、飞燕草素(Delphinidin,Dp)、芍药素(Peonidin,Pn)、牵牛素(Petunidin,Pt)及锦葵素(Malvidin,Mv)[4]。不同花色素具不同色泽,在不同环境条件下稳定性不一,在自然界中通常以糖苷键与糖类结合形成花色苷而稳定存在[5]。天竺葵素主要呈现为红色,在pH值<2时稳定存在;矢车菊素和芍药素常为洋红色,飞燕草素、牵牛素和锦葵素为紫色,在68条件下分别以无色的碳醇甲基和查尔酮形式存在,分别呈现为无色和亮黄色[6-7]。长期摄入花色苷含量丰富的植物产品,对抗癌、预防心血管疾病、维持血糖平衡具有积极效应[8-9]。因此,花色苷作为植物重要外观品质组成及营养保健功能性成分,广受研究者的热爱与关注[3,6,10-11]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2022年进行试验。刺葡萄和“夏黑”葡萄材料取自江西省农业科学院园艺研究所内葡萄园。“夏黑”葡萄和刺葡萄均为9年生自根苗,株行距2.3 m×3.8 m,双十字架低干小“V”形叶幕,栽培管理措施一致。刺葡萄和“夏黑”葡萄幼嫩叶片于3月22日取得。每种材料各取3个生物学重复,带回实验室后液氮速冻保存,送至武汉迈维代谢生物有限公司进行检测。

1.2 方法

1.2.1 花色苷提取 利用球磨仪将幼叶材料研磨(30 Hz,1.5 min)至粉末状,称取50 mg粉末,加入500 μL提取液(50%甲醇水溶液,含0.1%盐酸),涡旋5 min,超声5 min,离心3 min(12 000 转/min,4 ℃),吸取上清液,沉淀再重复提取1次。合并两次上清液,用微孔滤膜(0.22 μm pore size)过滤后,保存于进样瓶中,用于LC-MS/MS分析[16]。花色苷含量为测得的6类花色苷含量总和。

1.2.2 花色苷类物质色谱检测分离 使用WatersTMACQUITY UPLC-PDA检测器分离花色苷。色谱柱为BEH C18[2.1 mm(内径)×100 mm,粒径1.7 μm],柱温40 ℃;进样量2 μL,检测波长520 nm。流动相A为超纯水(加入0.1%甲酸),B相为甲醇(加入0.1%甲酸),流速0.35 mL/min。洗脱梯度(以B相体积占比计):0～6 min为5%～50%,6～12 min为50%～95%,保持2 min,14 min降至5%,并平衡2 min[16]。

1.2.3 花色苷定性和定量检测 基于标准品构建MWDB(Metware Database)数据库,对质谱检测的数据进行定性分析。质谱条件:电喷雾离子源(Electrospray Ionization,ESI)温度550 ℃,正离子模式下质谱电压5 500 V,气帘气(Curtain Gas,CUR)241.32 kPa(35 psi)。在Q-TrapTM6500+质谱系统中,每个离子对根据优化的去簇电压(Declustering Potential,DP)和碰撞能(Collision Energy,CE)进行扫描检测[17-18]。

定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式(Multiple Reaction Monitoring,MRM)分析完成。供试标准品详见表1,均分别配制成浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、10 00、2 000、5 000 ng/mL溶液。获取各个浓度标准品对应质谱峰强度数据,以标准品浓度(Concentration)为横坐标,峰面积(Area)为纵坐标,绘制不同物质的标准曲线。将检测到的样本检测液积分峰面积代入相应物质的标准曲线线性方程进行计算,获得样本检测液中某物质的浓度(c),再计算样本中某物质的含量。计算式:样本某代谢物含量(μg/g)= (cV/m)×10-6[17-18]。式中,c为样本检测液中某物质浓度(ng/mL),V为提取时所用溶液体积(μL),m为称取的样本质量(g)。

1.3 数据处理

采用SPSS软件进行方差及显著性(α=0.05)分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄幼叶花色苷含量及组成

从表2可看出,刺葡萄幼叶总花色苷、锦葵素类、矢车菊素类、芍药素类和天竺葵素类花色苷含量均显著高于夏黑葡萄幼叶,飞燕草素类和牵牛素类花色苷含量显著低于夏黑葡萄幼叶。在刺葡萄幼叶总花色苷中,芍药素类、矢车菊素类、锦葵素类、牵牛素类、天竺葵素类和飞燕草素类花色苷的占比分别为74.21%、12.33%、11.61%、1.55%、0.21%和0.08%;在夏黑葡萄幼叶总花色苷中,芍药素类、矢车菊素类、牵牛素类、锦葵素类、飞燕草素类和天竺葵素类花色苷占比分别为41.86%、36.52%、11.83%、6.46%、3.15%和0.18%。可见,与刺葡萄幼叶相比,夏黑葡萄幼叶花色素的组成更加均衡。

表2 刺葡萄和夏黑葡萄幼叶样品各类花色苷含量 μg/g

2.2 葡萄幼叶前8单体花色苷组成及含量

在测得的所有单体花色苷中,取含量排名前8的单体花色苷进行比较分析。发现,刺葡萄幼叶主要的单体花色苷包括芍药花素-3,5-O-二葡萄糖苷、锦葵素-3,5-O-二葡萄糖苷和芍药花素-3-O-葡萄糖苷等,含量分别为2 219.81、307.66和171.72 μg/g。夏黑葡萄幼叶主要单体花色苷为芍药花素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3,5-O-二葡萄糖苷等,含量分别为122.40、102.66、56.68 μg/g。在含量前3的单体花色苷中,锦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷是刺葡萄幼叶的的特异组分,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷是夏黑葡萄幼叶的特异组分(见图1)。

图1 刺葡萄和夏黑葡萄幼叶样品含量排名前8的单体花色苷组成及含量

2.3 葡萄幼叶不同糖类花色苷种类及含量

由表3可知,夏黑葡萄幼叶花色苷种类数比刺葡萄幼叶多。在花色苷组成含量上,刺葡萄嫩叶以二葡萄糖花色苷为主,夏黑葡萄嫩叶以单糖花色苷为主(见表3)。

2.4 葡萄幼叶不同修饰成分花色苷含量

在测定的花色苷中,刺葡萄幼叶被修饰花色苷比例(91.12%)高于夏黑葡萄幼叶(73.65%)。甲基化是主修饰类型,其次为香豆酰化,乙酰化和丙二酰化修饰比例较小(见表4)。

表4 刺葡萄和夏黑葡萄幼叶样品不同修饰成分花色苷含量及比例

3 讨论与结论

作为植物的一类重要次生代谢产物,花色苷广泛存在于植物叶、花及果实等组织中,不同组织间花色苷组成和含量存在明显差异,总体表现为果皮高于叶子、叶子高于种子、种子高于果肉[10]。刺葡萄从幼叶到成熟叶片,相继经历了从红变绿整个过程[19]。本试验发现,“夏黑”葡萄和刺葡萄幼叶早期呈现红色,其显红色的主要原因是芍药花素类衍生物的积累;其中,刺葡萄幼叶花色苷含量显著高于夏黑葡萄幼叶。

花色素由于结构的不稳定性,常会通过分子修饰形成稳定物质。常见的修饰类型包括糖基化、甲基化、酰基化、香豆酰化等。花色素的糖基化和甲基化使颜色更红,而酰基化改变波长吸收最大值,使颜色更蓝。其中,花青素类花色苷(包括矢车菊色素类和芍药花素类花色苷)衍生物含量越高,果实红色至紫红色色调越强;花翠素类花色苷(包括飞燕草素类、牵牛素类和锦葵素类花色苷)衍生物含量越高,果实的蓝紫色调越强[20-22]。本试验发现,呈紫红色调的刺葡萄嫩叶与夏黑葡萄嫩叶花色苷主要成分为芍药花素类衍生物。其中,紫色调明显的刺葡萄幼叶含有锦葵素类衍生物,以二葡萄糖苷为主,修饰程度大于夏黑葡萄幼叶;呈红色调的夏黑葡萄幼叶含有矢车菊素类衍生物,以单葡萄糖苷为主。这也说明了野生资源刺葡萄幼叶花色苷以二葡萄糖苷为主,与果皮一致[15,23]。刺葡萄幼叶明显的紫色调和夏黑葡萄幼叶红色调分别是因为锦葵素类衍生物和矢车菊素类衍生物的特殊积累。

植物色素不仅在植物生长发育中发挥重要作用,对人体营养保健也具一定功效。由于植物色素的不稳定性,其作为天然色素在食品染色工业中的开发与利用也受到限制[24]。葡萄作为我国重要果树种类,其果皮花色苷的研究报道已有很多,但关于幼叶花色苷的研究甚少[24-25]。杨腊等[26]利用3种不同的刺葡萄叶片(嫩尖、黄绿色幼叶、红褐色幼叶)制叶茶的研究表明,红褐色幼叶更具叶茶开发利用价值。本试验通过对刺葡萄幼叶和夏黑葡萄幼叶进行定性定量分析的结果表明,花色苷总含量(以幼叶鲜质量计)分别为3 452.16和565.17 μg/g;刺葡萄幼叶中含量最高的花色苷为芍药花素-3,5-O-二葡萄糖苷;夏黑葡萄幼叶含量最高的花色苷为芍药花素-3-O-葡萄糖苷。可见,刺葡萄幼叶花色苷含量高,具有很大的开发利用前景,值得我们深入探究。