硝酸银对刺梨愈伤组织酚类物质含量及相关酶活性的影响

李婷婷,陈 红

(贵州大学/国家林业和草原局刺梨工程技术研究中心,贵阳,550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)是中国特有的果树资源,具有很高的营养保健价值。近年来,刺梨已作为贵州省重要的特色果树产业被大力发展,但现有品种主要是通过野生驯化而来,且品种比较单一,远不能满足广大消费者的多元化需求,因此,开展资源创新及新品种培育势在必行。植物细胞工程作为资源创新的有效手段,已在月季[1]、桑树[2]、柑桔[3]、火龙果[4]等很多园艺植物上被广泛应用并获得了变异植株。此外,通过完善的离体再生体系已成功获得了猕猴桃[5]和苹果[6]的转基因植株。目前,在刺梨上通过植物细胞工程手段创建新材料的研究鲜见报道,仅个别研究者对刺梨花药[7]和未受精胚珠[8]的愈伤组织诱导等进行了研究,并分化出少量的类原球茎,但最终未能萌发成植株。其主要原因是刺梨含有大量的酚类化合物[9-11],易导致愈伤组织褐化死亡,使得刺梨离体再生体系的建立极为困难。近年来,已有相关学者采用吸附剂或抑制剂抑制刺梨愈伤组织褐化[12],但刺梨愈伤组织褐化机理尚未见深入系统的研究报道。相关研究表明,愈伤组织发生褐化的原因与愈伤组织中酚类化合物的含量及多酚氧化酶(PPO)活性、过氧化物酶(POD)活性有直接关系[13-21],抑制酚类物质的形成、提高POD活性、降低PPO活性的确可以减轻褐化[22-26]。本课题组前期的研究发现,硝酸银(AgNO3)抑制刺梨愈伤组织褐化的效果是最佳的。因此,本研究则以4种基因型刺梨叶片愈伤组织为试材,在培养基中添加不同浓度AgNO3,测定在培养过程中总酚含量、过氧化物酶活性、多酚氧化酶活性的动态变化,分析愈伤组织褐化与总酚含量、过氧化物酶活性、多酚氧化酶活性之间的关系,探讨引起刺梨愈伤组织褐化的生理机制,筛选抑制褐化效果最佳的AgNO3浓度,为控制刺梨愈伤组织褐化提供理论依据,为刺梨再生体系的建立以及资源创新奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料供试刺梨品种为“贵农1号”“贵农2号”“贵农5号”“贵农7号”,以各品种继代两次的幼嫩叶片愈伤组织为试材。试验前的叶片愈伤组织培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,光照培养时间为16 h/d,培养时间为30 d。

1.2 方法选择生长健壮的愈伤组织分别接种于添加不同浓度AgNO3(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L)的MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA+30.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂培养基上,以未添加AgNO3作为对照。每个处理分别接种30瓶,每瓶接种愈伤组织5～8团,重复3次。接种后培养条件为:光照强度1 500～2 000 lx,光照时间12 h/d,温度(25±0.5) ℃。培养30 d后统计褐化率。褐化率=(褐化外植体数/接种外植体总数)×100%。培养10、20、30 d分别测定总酚含量、过氧化物酶活性、多酚氧化酶活性。

总酚含量的测定使用北京索莱宝科技有限公司的植物总酚含量检测试剂盒,每个重复3次[27]。经测定得到的标准曲线为y=3.418 4x+0.071 8(R2=0.991 3)。总酚含量(mg/g)=2.5y÷m。式中:y为标准管浓度;m为样本质量,0.1 g。

POD活性的测定使用北京索莱宝科技有限公司的过氧化物酶活性检测试剂盒,每个处理3次重复[28]。每分钟每g组织在每mL反应体系中470 nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。POD(U/g)=(4 900×ΔA)÷m。式中:ΔA=A2-A1;m为样本质量,0.1 g。

PPO活性测定使用北京索莱宝科技有限公司的过氧化物酶活性检测试剂盒,每个处理3次重复[29]。每分钟每g组织在每mL反应体系中410 nm处吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位。PPO(U/g)=(120×ΔA)÷m。式中:ΔA=A测定-A对照;m为样本质量,0.1 g。

1.3 数据处理采用IBM SPSS STATISTIC 23.0软件进行分析并用R包绘制热图。

2 结果与分析

2.1 AgNO3对刺梨愈伤组织褐化的影响试验结果看出,不同基因型叶片愈伤组织褐化率随AgNO3浓度升高的变化一致,均为先降低后升高,当AgNO3浓度为0.4 g/L时叶片愈伤组织褐化率均达到最低值;同一基因型,不同AgNO3浓度间的褐化率差异极显著(p<0.01);不同AgNO3浓度处理褐化率的大小关系在不同基因型间表现一致(见表1)。4种基因型叶片愈伤组织在添加不同浓度AgNO3的培养基上培养30 d生长状态见图1、图2、图3和图4。

图1 不同浓度AgNO3对“贵农1号”刺梨叶片愈伤组织褐化的影响

图2 不同浓度AgNO3对“贵农2号”刺梨叶片愈伤组织褐化的影响

图3 不同浓度AgNO3对“贵农5号”刺梨叶片愈伤组织褐化的影响

图4 不同浓度AgNO3对“贵农7号”刺梨叶片愈伤组织褐化的影响

表1 不同浓度AgNO3下刺梨叶片愈伤组织的褐化率

2.2 AgNO3对刺梨愈伤组织总酚含量的影响

相同培养时间,“贵农5号”刺梨叶片愈伤组织总酚含量随培养基中AgNO3浓度增加呈先降低后回升,对照(0 g/L,未添加AgNO3)的总酚含量均高于添加AgNO3的处理。在培养10、20和30 d,均以AgNO30.4 g/L处理的总酚含量最低,分别为148.67、139.32和148.11 mg/g。总酚含量越低,褐化越轻。综合分析,以AgNO30.4 g/L培养20 d的效果最好(见表2)。

表2 “贵农5号”刺梨叶片愈伤组织在不同浓度AgNO3培养基上培养的总酚含量

2.3 AgNO3对刺梨愈伤组织过氧化物酶活性的影响相同培养时间,“贵农5号”叶片愈伤组织POD活性随AgNO3浓度升高表现为先升高后降低,均以AgNO3浓度为0.4 g/L时最高。培养10和20 d,AgNO3各处理的POD活性均高于对照(0 g/L,未添加AgNO3);培养30 d,除AgNO30.5 g/L处理的POD活性与对照无显著差异外,其余各AgNO3处理的POD活性均高于对照。AgNO30.4 g/L处理下培养20 d,叶片愈伤组织POD活性最高,为49.00 U/g(见表3)。

表3 “贵农5号”刺梨叶片愈伤组织在不同浓度AgNO3培养基上培养的过氧化物酶活性

2.4 AgNO3对刺梨愈伤组织多酚氧化酶PPO活性的影响相同培养时间,愈伤组织PPO活性随AgNO3浓度增加先降低再小幅回升,各AgNO3处理的PPO活性均极显著低于对照(未添加AgNO3),其中AgNO30.4 g/L处理的PPO活性最低。这表明添加AgNO3处理均可降低PPO活性。其中,AgNO30.4 g/L处理下培养20 d,叶片愈伤组织PPO活性最低,为17.76 U/g(见表4)。

表4 “贵农5号”刺梨叶片愈伤组织在不同浓度AgNO3培养基上培养的多酚氧化酶活性

2.5 总酚含量、POD活性、PPO活性与褐化率的相关性相关性分析结果表明,刺梨叶片愈伤组织总酚含量与褐化率呈极显著(p<0.01)正相关性,培养10、20和30 d的相关系数分别为0.818、0.922和0.947。POD活性与褐化率呈极显著(p<0.01)负相关,培养10、20和30 d的相关系数分别为-0.936、-0.896和-0.701。PPO活性与褐化率呈极显著(p<0.01)正相关,培养10、20和30 d的相关系数分别为0.949、0.984和0.980。同时,总酚含量与POD活性之间和POD活性与PPO活性之间呈极显著负相关,总酚含量与PPO活性之间呈极显著正相关(见图5)。

注:总酚、POD和PPO后数字指培养时间(单位为d);**表示在0.01水平上显著相关。

3 讨论

3.1 AgNO3的抗褐化作用AgNO3作为抗褐化剂用于园艺植物的组织培养[12,30-36],不仅可促进愈伤组织生长,还可有效控制褐化的发生。有研究发现,在培养基中添加AgNO3能够影响葡萄愈伤组织酚类物质的含量[32],而减少酚类物质合成可以有效减轻褐化[22,34]。在本研究中,添加AgNO3各处理的刺梨叶片愈伤组织的褐化率明显低于对照(未添加AgNO3),这可能是因为总酚的形成受到抑制,继而减少了醌类物质的形成,降低了刺梨叶片愈伤组织褐化的程度。当AgNO3浓度为0.4 g/L时,4个基因型刺梨的叶片愈伤组织褐化率均达到最低值,与其他处理存在极显著差异。当AgNO3浓度升为0.5 g/L时,4个基因型刺梨的叶片愈伤组织褐化率又明显升高,这可能是因为Ag+是重金属,其增加至一定浓度会破坏植物体内的酶蛋白结构,细胞的代谢活动因此受阻,继而产生了毒害作用[34]。

3.2 AgNO3抑制褐化的机理本研究发现,在培养基中添加AgNO3后,刺梨叶片愈伤组织PPO活性和总酚含量均低于对照(未添加AgNO3),这与郑超等[24]、岑忠用等[25]和许传俊等[26]的研究结果相似。说明,添加适宜浓度的AgNO3有利于降低刺梨叶片愈伤组织的PPO活性,同时能抑制其总酚的形成和积累,从而表现出抗褐化作用。当AgNO3浓度升高至0.5 g/L时,可能由于部分AgNO3与某些氨基酸发生反应生成棕褐色物质,反而在一定程度上加剧了刺梨叶片愈伤组织褐化的程度,导致了细胞的损伤和死亡,继而提高了PPO活性。培养10、20和30 d时,均是褐化严重的刺梨叶片愈伤组织的POD活性低于褐化程度较轻的POD活性,说明POD参与了刺梨叶片愈伤组织的褐化过程,POD脱除组织中的过氧化氢和超氧阴离子,保护细胞膜的通透性,能抑制褐化现象的发生[36]。本试验表明,随着培养基中AgNO3浓度的增加,刺梨叶片愈伤组织POD活性、PPO活性和总酚含量呈现一定的规律性变化,适宜浓度的AgNO3处理有利于降低刺梨愈伤组织的PPO活性,提高POD活性,抑制总酚的形成和积累,从而可抑制愈伤组织的褐化。

4 结论

在培养基中添加0.4 g/L AgNO3抑制刺梨叶片愈伤组织褐化的效果最好,供试不同刺梨品种中“贵农5号”的叶片愈伤组织褐化程度最轻。在添加0.4 g/L AgNO3的培养基上培养20 d时,刺梨叶片愈伤组织的总酚含量最低,POD活性最高,PPO活性最低。刺梨叶片愈伤组织总酚含量、PPO活性分别与褐化率呈极显著正相关,POD活性与褐化率呈极显著负相关。