电感耦合等离子体质谱法测定咪达唑仑注射液中18 种元素杂质含量

胡 幸，沈丹丹，匡鑫玉，陈丹丹，张 伟△

（1. 重庆市食品药品检验检测研究院·国家药品监督管理局麻醉精神药品质量监测重点实验室，重庆 401121；2. 重庆大学生物工程学院，重庆 400044）

咪达唑仑注射剂属第二类精神药品，具有催眠、抗焦虑和镇静作用，临床应用广泛［1］。目前，国内咪达唑仑注射液有3 个生产厂家（共6 个规格），其中2 个生产厂家（共5个规格）通过一致性评价。咪达唑仑原料药合成工艺中使用了锰（Mn）、钛（Ti）、镍（Ni）等元素［2］，咪达唑仑注射液生产过程中也易通过原料药、辅料、包装材料、注射用水、生产设备等引入元素杂质［3-4］，造成元素杂质超过允许日暴露量（PDE）。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法检测灵敏度高、准确度好、动态线性范围宽、分析速度快，可同时测量多种元素［5-6］，在痕量金属元素测定中应用广泛［7-9］。为保障用药安全，参照《化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究技术指导原则（试行）》、人用药品技术要求国际协调理事会（ICH）Q3D 元素杂质指南（以下简称ICH Q3D）和2022年版《美国药典》233 Elemental Impurities：Procedures，本研究中建立了测定咪达唑仑注射液中18种元素杂质残留量的ICP - MS 法，为评估元素杂质残留风险提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

NexION 2000 型ICP - MS 仪（美国PerBinElmer 公司）；Milli-Q 型超纯水仪（美国Millipore 公司）。

1.2 试药

汞（Hg）单元素标准溶液（编号为GSB 04 - 1729 -2004，质量浓度为1 000 µg/mL），多元素标准溶液［含Mn，Ti，Ni 及镁（Mg）、铝（Al）、钒（V）、铬（Cr）、铁（Fe）、钴（Co）、铜（Cu）、锌（Zn）、砷（As）、锶（Sr）、镉（Cd）、锑（Sb）、钡（Ba）、铅（Pb），编号为GSB 04-1767-2004，质量浓度为100 µg/mL］，铼（Re）、铑（Rh）混合标准溶液（内标，编号为GNM - M022949 - 2013，质量浓度为1 000 µg/ mL），均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；钪（Sc）、铟（In）混合标准溶液（内标，珀金埃尔默公司，编号为N9303832，质量浓度为10 µg/mL）；68%硝酸溶液（UPS级，批号为220615263），37%盐酸溶液（UPS 级，批号为220308126），均购自苏州晶瑞化学股份有限公司；咪达唑仑注射液（A厂家，规格为每支2 mL∶10 mg，批号分别为M201011，M201205，M201208）。

2 方法与结果

2.1 ICP-MS 试验条件

等离子体射频功率：1500W；等离子体气流速：15L/min；辅助气流速：1.2 L/ min；雾化气流速：0.86 L/ min；雾化室温度：20 ℃；碰撞气：氦气；碰撞气流速：3.8 mL/min；扫描次数：20次；采集次数：3次。测定时24Mg，27Al，48Ti，51V，52Cr，55Mn，56Fe，59Co 以45Sc 作为内标，60Ni，63Cu，66Zn，75As，88Sr，111Cd，121Sb，137Ba 以115In 作为内标，202Hg和208Pb以187Re作为内标。

2.2 溶液制备

稀释剂：取68%硝酸溶液60 mL、37%盐酸溶液5 mL，置2 000 mL 塑料容量瓶中，用超纯水稀释并定容，摇匀，即得。

混合内标溶液（45Sc，115In，187Re）：精密量取Re 和Rh混合标准溶液（质量浓度为1 000µg/mL）0.5 mL，置50 mL容量瓶中，用稀释剂稀释成质量浓度为10µg/mL的溶液；再精密量取In和Sc混合标准溶液（质量浓度为10µg/mL）及Re和Rh混合标准溶液（质量浓度为10µg/mL）各适量，用稀释剂分别稀释成质量浓度为5 ng/ mL 和10 ng/mL的溶液。

标准贮备液：分别精密量取Hg单元素标准溶液（质量浓度为1 000 µg/mL）0.25 mL、多元素标准溶液（质量浓度为100 µg/mL）2.5 mL，置同一50 mL 塑料容量瓶中，用稀释剂稀释成质量浓度为5 µg/mL 的标准贮备液A；取1 mL 标准贮备液A，置50 mL 容量瓶中，用稀释剂稀释成质量浓度为100 ng/mL的标准贮备液B。

标准曲线溶液：精密量取标准贮备液B 适量，用稀释剂稀释成含Ti，V，Co，As，Cd，Hg，Pb 质量浓度分别为0.1，0.5，2，4，6，10，25 ng/ mL 的系列溶液；精密量取标准贮备液A 适量，用稀释剂稀释成含Mg，Al，Cr，Mn，Fe，Ni，Cu，Zn，Sr，Sb，Ba 质量浓度分别为0.1，0.5，6，25，50，75，100，150，200 ng/mL 的系列溶液。

100%加标供试品溶液：取样品5 mL与标准贮备液B 2 mL，置同一50 mL 容量瓶中，用稀释剂定容，作为Ti，V，Co，As，Cd，Hg，Pb 100%加标供试品溶液B；另取样品5 mL 与标准贮备液A 0.5 mL，置同一50 mL 容量瓶中，用稀释剂定容，作为Mg，Al，Cr，Mn，Fe，Ni，Cu，Zn，Sr，Sb，Ba 100%加标供试品溶液A。

加速试验100%加标供试品溶液：取样品适量，分别置温度为（40±2）℃、相对湿度为（75±5）%的条件下1个月、3个月，即得加速试验样品，按100%加标供试品溶液制备方法制备加速试验100%加标供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取2.2 项下系列标准曲线溶液，按2.1项下ICP-MS 试验条件进样测定，以内标溶液进行在线校正，以待测元素的质量浓度（X，ng/ mL）为横坐标、待测元素与所选内标元素响应信号值的比值（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 方法学考察结果Tab.1 Results of the methodelogical investigation

检测限与定量限确定：取线性关系考察项下溶液，按2.1 项下ICP - MS 试验条件进样测定，按公式计算检测限（LOD）和定量限（LOQ），LOD= 3SD/k，LOQ=10SD/k。式中，SD为连续测定11 次空白溶液吸光度的标准差，k为标准曲线的斜率。结果见表1。

精密度试验：精密吸取2.2 项下100%加标供试品溶液A 和B 各适量，按2.1 项下ICP-MS 工作条件连续进样测定6次。结果见表1，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取样品（批号为M201011）适量，按2.2 项下方法制备100%加标供试品溶液A 和B，分别于室温放置0，2，4，8 h时按2.1项下ICP-MS试验条件进样测定。结果见表1，表明供试品溶液在室温放置8 h内稳定性良好。

重复性试验：取2.2 项下100%加标供试品溶液A和B各6份，按2.1项下ICP-MS试验条件进样测定。结果见表1，表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取样品5 mL，置50 mL 容量瓶中，平行9 份，分别加入标准贮备液B 1，2，3 mL，各3 份，用稀释剂定容，摇匀，分别作为50%，100%，150%3 个浓度水平的加标供试品溶液B（Ti，V，Co，As，Cd，Hg，Pb）；另精密量取样品5 mL，置50 mL 容量瓶中，平行9份，分别加入标准贮备液A 0.25，0.50，0.75 mL，各3 份，用稀释剂定容，摇匀，分别作为50%，100%，150%3 个浓度水平的加标供试品溶液A（Mg，Al，Cr，Mn，Fe，Ni，Cu，Zn，Sr，Sb，Ba）。精密吸取50%，100%，150%加标供试品溶液A 和B 各适量，按2.1 项下ICP-MS 试验条件进样测定，结果见表1。

2.4 元素杂质限度计算

咪达唑仑每日最大用量为338.5 mg，规格为5 mg/mL，制剂日最大用量为67.7 mL。参照ICH Q3D，日最大剂量低于2 L时由PDE计算允许浓度。允许浓度（µg/g）=PDE/每日剂量。以最大允许浓度限度的30%为控制阈值。Fe 和Zn 元素的PDE 参考《化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究技术指导原则（试行）》中列出的值；Mn 元素的PDE 参考欧洲药品管理局（EMA）发布的《金属催化剂或金属试剂残留量限度规定的指导文件》；Al，Mg，Ti，Sr 元素在ICH Q3D 及其他原则中无推荐的PDE，由于其毒性较低，本研究中按ICH Q3D 中限值最高的PDE 1 500µg/d 进行风险初步评估；其余元素按ICH Q3D 注射途径规定的PDE 值计算。结果见表2。

表2 咪达唑仑注射液中元素杂质的允许日暴露量与允许浓度Tab.2 Permissible daily exposure and permissible concentrations of heavy metals and harmful elements in Midazolam Injection

2.5 样品含量测定

取2.2 项下100%加标供试品溶液和加速试验100%加标供试品溶液，按2.1 项下ICP - MS 试验条件进样测定，结果见表3。可见，3 批样品中18 种元素杂质均符合限值要求。其中Al 和Ba 的含量较高，可能存在元素迁移情况，其余元素杂质含量远低于限度的30%，表明咪达唑仑注射液在生产过程中引入的元素杂质残留基本可控。此外，加速试验条件下，由于注射剂与玻璃包装容器相互作用，Al，Mn，Sr，Ba元素杂质可能存在迁移情况，但影响药品安全性的风险较低。

表3 样品中元素杂质含量测定结果（μg/g）Tab.3 Results of content determination of elemental impurities in samples（μg/g）

3 讨论

3.1 基质干扰

ICP-MS 分析会出现同位素、多原子离子、双电荷离子等光谱干扰及基质效应、记忆效应等非光谱干扰［10-11］。咪达唑仑注射液处方中均使用了氯化钠（9 mg/ mL 和5 mg/ mL）作为渗透压调节剂，故元素杂质测定易受高钠含量的基质干扰。本研究中通过合理的稀释方式，降低了高钠含量的基质干扰，并采用氦气碰撞反应池技术减少多原子光谱的干扰。

3.2 样品制备

样品制备是元素杂质分析的关键步骤，应注意防止待测元素的损失及二次污染。相比于间接溶解法，直接溶解法简化了操作步骤［12］，在一定程度上减少了目标元素的损失，适用于快速筛查和常规监测元素杂质。在选择合适的溶剂溶解样品时，除考虑样品的化学稳定性与挥发性外，还应考虑样品中目标元素的稳定性。咪达唑仑注射液易溶于稀硝酸溶液，拟在室温下直接将适量咪达唑仑注射液溶于3%硝酸溶液；此外，由于Hg 元素的挥发性较强，需添加稳定剂以避免回收率过低［13］；盐酸可以络合Hg2+，确保离子在溶液中稳定，避免延迟效应和记忆效应［14-15］。故本研究中最终采用含0.25%盐酸溶液的3%硝酸溶液来溶解样品。

3.3 方法评价

本研究中建立了定量测定咪达唑仑注射液中18种元素杂质含量的ICP - MS 法，该方法具有多元素同时分析、各元素线性范围宽、灵敏度和精密度高等优点，可用于咪达唑仑注射液中元素杂质的含量测定与风险评估。