我国果实种子类中药材黄曲霉毒素污染状况及防控策略研究进展

张西梅, 焦晓林, 苏春燕, 罗 毅, 张 蕾, 高微微

(1. 泰山学院生物与酿酒工程学院，泰安 271000；2. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；3. 北京城市学院生物医药学部，北京 100094；4. 河北中医药大学药学院，石家庄 050200；5. 山东宏济堂制药集团股份有限公司，济南 250103)

黄曲霉毒素(aflatoxins,AFs)是由曲霉属Aspergillus真菌产生的化学结构为二氢呋喃香豆素类的系列化合物,具有致癌、致畸、致突变等毒性。目前已发现的AFs有20余种,以黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)最常见,其中AFB1的毒性最强,1993 年被世界卫生组织癌症研究机构(IARC-WHO)划定为ⅠA 级致癌物[1]。中药材作为中医的主要物质基础在我国被广泛应用,药用植物在采收后一般需要经过各种干燥加工过程,植物不同器官加工后成为根(茎)类、叶类、花类、皮类、果实种子类等中药材。药用植物的采后病害主要体现在真菌污染导致的霉变,其中果实种子类药材由于富含淀粉、多糖、脂肪和蛋白质,是中药材中易受AFs污染的主要类别。2020版《中华人民共和国药典》(后文简称为《中国药典》)共收载144种果实种子类药材,其来源植物及生产加工方式有很大差异,AFs污染的风险也有所不同。其中药食两用的莲子、薏苡仁[2]、酸枣仁、柏子仁等出现AFs污染的情况非常普遍[3-4],控制此类中药材AFs的污染在保障中药材安全方面尤为重要。2010版《中国药典》首次规定了5种药材的AFs限量要求,至2020版增加到24种,其中果实种子类药材有14种[5]。本文针对此类中药材中AFs污染现状、污染途径、国内外相关的限量标准进行综述,并提出在采收、加工、贮藏等采后环节AFs污染的防控措施和建议,为AFs污染的防控以及相关标准的制订提供参考。

1 果实种子类药材黄曲霉毒素污染现状

利用中国知网(CNKI)数据库,用“中药+黄曲霉毒素”进行主题检索,共检索到488篇相关文献(1995年-2022年),其中果实种子类中药材AFs污染报道的文献共计54篇,污染药材数量呈现逐年增长的趋势(图1)。蔡飞等综述了从1995年至2005年中药材AFs污染的情况,仅有7篇相关文献,涉及此类药材27种,AFB1检出量普遍较高,其中薏苡仁、柏子仁、豆蔻、山茱萸、陈皮、益智仁、淡豆豉、胖大海、青皮、佛手、五味子、枳壳、枳实、罗汉果、芡实等15种药材AFB1的最大检出量均超过100 μg/kg,占测定药材数量的55%,这其中五味子、青皮的检出量甚至达到500 μg/kg以上[6]。2006年-2010年间,文献数量虽然仅6篇,但涉及药材增加至35种,其中益智仁AFB1的最大检出量为202.9 μg/kg[7],其他药材如薏苡仁、苦杏仁、酸枣仁、白芥子、砂仁检出量均超过 5 μg/kg[7-11]。

图1 1995年-2022年果实种子类药材AFs污染状况Fig.1 Aflatoxins contamination of fruits and seeds medicinal materials in 1995-2022

《中国药典》2010年版首次规定了5种中药材AFs的检测方法及限量要求,开启了国家层面对中药AFs污染水平的管理和监测。2011年-2015年,相关研究文献数量增加至25篇,药材种类增加到48种,筛查出一些AFs容易超标的高风险品种,如莲子(AFB1检出量1 300 μg/kg)[12]、砂仁(AFB1检出量139.93 μg/kg)[13]、肉豆蔻(AFs检出量290.8 μg/kg)、马钱子(AFs检出量158.9 μg/kg)[14],检出量超过限量的还有薏苡仁、柏子仁、陈皮、桃仁、麦芽、决明子、瓜蒌皮、酸枣仁、苦杏仁、槟榔、使君子、枸杞子。《中国药典》2015年和2020年版的监测品种进一步增加到19种和24种,其中果实种子类的数量达到13种和14种,在这个阶段报道的污染药材新增加了栀子,而之前报道易污染的薏苡仁、莲子、酸枣仁AFs检出量仍保持较高水平(108～376 μg/kg)[2,15-16]。

蔡飞等[6]综述了2010年之前我国有关中药材及中成药AFs污染状况,报道 2次以上的果实种子类药材有12种,其中山茱萸、五味子、豆蔻、柏子仁、益智仁、桃仁、薏苡仁、陈皮、青皮、胖大海中AFB1检出量均超过药典限量的10倍以上。2011年至2022年,共30种药材中报道检测到AFs。报道10次以上的药材有柏子仁、薏苡仁、酸枣仁3种,其中柏子仁、酸枣仁中AFB1最高检出量均超过药典限量(5 μg/kg)的15倍以上;报道6～9次的有桃仁、莲子、槟榔、麦芽、肉豆蔻、苦杏仁、决明子7种,其中肉豆蔻、莲子中AFB1最高检出量分别超过药典限量的15倍、260倍以上;报道2～5次的药材有7种,其中砂仁、马钱子污染最为严重,AFs最高检出量均超过药典限量(10 μg/kg)的13倍以上;另外,只有1次报道的补骨脂AFB1及AFs,瓜蒌皮的 AFB1检出量超过药典限量(表1)。

表1 2011年-2022年国内报道AFs污染超过药典限量的果实种子类中药材1)Table 1 Fruit and seed medicinal materials with AFs content exceeding the pharmacopoeia limit reported in China in 2011-2022

2 国内外黄曲霉毒素的限量标准

建立限量标准和法规是实现AFs风险性管理的有效措施。我国从2010年版《中国药典》开始增加AFs测定方法,并在5种中药材检查项下增加了AFs限量,其中包括4种果实种子类药材(陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海),至2020年版AFs限量的果实种子类药材增加到14种。使用中药较多的国家和地区也对部分中药材及其相关制品制定了AFs限量标准。我国台湾地区规定了13种药材AFs总量的限量标准,其中包括10种果实种子类药材;韩国食品医药品安全厅对15种药材规定了AFB1和AFs总量的限量,其中果实种子类药材共9种; 欧盟和越南规定了胡椒和肉豆蔻的AFs限量标准(表2)。

表2 国内外对中药材中AFB1和AFs的限量标准1)Table 2 Maximum allowed levels of AFB1and total AFs in medicinal plants in and outside China

肉豆蔻、莲子、大枣、桃仁、槟榔、酸枣仁、胡椒在多个国家和地区均有AFs限量的规定,可以认为这些药材的AFs污染较为普遍,是重点控制的种类;有些药材仅在某一国家或地区有限量标准,例如八角茴香、大腹皮、女贞子、小茴香、山茱萸、山楂和枸杞子仅在我国台湾有限量标准,而巴豆、白扁豆和瓜蒌仅在韩国有规定,表明这些药材上AFs污染受地域影响。就限量标准而言,AFB1多为5 μg/kg,包括中国、欧盟和越南;对于AFs总量的限量,中国台湾和韩国的规定均为15 μg/kg,而中国、欧盟和越南较为严格,限量值为10 μg/kg(表2)。

3 黄曲霉毒素的产生菌及影响因素

3.1 黄曲霉毒素的产生菌

目前文献报道的AFs产生菌至少有20种,均为曲霉属Aspergillus真菌,其中黄绿组Flavi中有14种,分别为花生曲霉A.arachidicola、家蚕曲霉A.bombycis、黄曲霉A.flavus、微小隐裂曲霉A.minisclerotigenes、A.mottae、集蜂曲霉A.nomius、寄生曲霉A.parasiticus、A.parvisclerotigenus、假稻曲霉A.pseudocaelatus、A.pseudonomius、假溜曲霉A.pseudotamarii、A.sergii、A.togoensis、A.transmontanensis;Ochraceorosei组中有2种,分别为A.ochraceoroseus、A.rambellii;巢状组Nidulantes中有4种,包括A.astellatus、A.miraensis、A.olivicola、A.venezuelensis[52]。其中黄曲霉A.flavus和寄生曲霉A.parasiticus是主要的AFs产生菌,通常情况,A.flavus只产生AFB1和AFB2,而A.parasiticus可以产生AFB1、AFB2、AFG1和AFG2[53]。

值得关注的是,A.flavus中存在产毒菌株和不产毒菌株。最新研究发现产毒基因缺失或单核苷酸多态性(SNPs)是造成A.flavus不能产生AFs的原因之一[54-55]。根据以往的研究报道和我们前期调查结果,发现从中药材分离的A.flavus产毒菌株的比率较低,但花生上分离的A.flavus产毒菌株的比率可达69%,而甘草、罂粟等中药材上分离的产毒菌株仅占31%[56],酸枣仁上分离的产毒菌株仅占9%[57]。

3.2 影响产毒菌生长和产毒的因素

3.2.1环境因素

真菌毒素的合成受环境温度、湿度、pH、二氧化碳含量[58]等外在因素影响,其中温度和湿度是影响菌株生长和AFs产生的主导因素。适合A.flavus的生长和AFs产生的温度和相对湿度的范围分别为26.7～43.3℃和62%～99%,最适温度和相对湿度分别为30℃和85%[59]。适合A.parasiticus的生长和产毒的温度和相对湿度的范围分别为25～35℃和14%～80%,最适温度和相对湿度分别为25℃和74%[60-61]。因此,生长在较为干旱地区的作物,可能更容易污染A.parasiticus。

3.2.2寄主特征

药材种类、化学成分、药材水分含量也与霉菌的生长和代谢活动密切相关。种子果实类药材的某些特殊结构,如槟榔、山茱萸、胖大海等果实类药材外面包裹着多汁、含糖的果肉,增加了这些药材被真菌污染风险;种子的种胚代谢活动强,包含有机物的种类多,霉菌容易繁殖,早期往往是胚部先出现霉斑[62];有些药材种子外面有坚硬的内果皮,如酸枣仁,加工过程中破除枣核(内果皮)时不可避免的损伤枣仁,从而增加污染真菌的概率[57];霉菌的菌丝和孢子数量因药材表面粗糙程度和裂隙大小而异,表面光滑的药材,如白果,一般不易观察到霉变特征[62]。

果实种子类药材富含淀粉、多糖、脂肪等,为产毒真菌的繁殖提供了营养。如莲子、薏苡仁等淀粉含量较高,胖大海、决明子等富含多糖,而柏子仁、酸枣仁、桃仁、使君子等脂肪含量较高,从而AFs污染的几率较高。植物次生代谢产物影响AFs污染报道较多的是挥发油类成分对产毒真菌的抑制作用[63],富含挥发油的果实种子类药材往往不易被A.flavus污染,如花椒,所含的花椒精油体积分数为0.5%时,对A.flavus的生长、分生孢子萌发、AFs的产生均有抑制作用[64]。

药材的水分含量是影响A.flavus生长以及AFs产生的主要因素。2020版《中国药典》有AFs的限量的14种果实种子类药材中,除大枣外,其他13种药材均有水分含量要求[5],但对这些药材的水分限量值差异较大,其中柏子仁(6.0%)、酸枣仁(9.0%)、桃仁(7.0%)的含水量限量最为严格,同时这3种药材也是AFs污染报道最多的药材(表1)。胖大海(16.0%)、陈皮(13.0%)、莲子(14.0%)、使君子(13.0%)、麦芽(13.0%)、决明子(15.0%)、薏苡仁(12.0%)、马钱子(13.0%)的含水量限量在12%～16%,在规定的含水量下是否可以控制污染,目前极少有报道。与水分含量相比,水活度是更有效反映食品品质的热力学概念指标,水活度代表基质中自由水的量,是微生物生长繁殖能利用的水分,已被广泛作为食品安全控制和质量控制的指标,但在药材安全相关的研究和应用方面相对缺乏[65],药事法规中还没有相关规定。

4 黄曲霉毒素的污染环节及防控措施

产毒真菌广泛存在于空气、水源、土壤中,是造成中药材及其相关产品AFs污染的主要来源。不恰当的种植、采收、储藏、加工及运输等操作,极易导致中药材滋生产毒真菌,一旦产生AFs污染便很难除去,因此,限制产毒菌的生长和繁殖是控制AFs污染的关键。

4.1 田间生物防控

生物防控技术是利用非产毒菌的生存竞争和微生物之间的拮抗作用来抑制产毒真菌的侵染和产毒。目前美国、澳大利亚已经将非产毒菌株应用到花生、玉米等大田作物中来抑制AFs的形成,利用非产毒的A.flavus和A.parasiticus处理花生种植田,花生中AFs含量降低97%～98%[66],美国环境保护署(United States Environmental Protection Agency,EPA)已经批准2株非产毒A.flavus作为花生和棉花上控制AFs污染的生物菌剂[67]。

利用拮抗菌防控AFs污染也有很多研究。室内抑菌试验筛选出的乳酸菌Lactobacillusspp.[68]、芽胞杆菌Bacillusspp.[69]、假单胞菌Pseudomonasspp.、伯克氏菌Burkholderiaspp.等细菌,以及假蜜环菌Armillariatabescens[70]、黑曲霉Aspergillusniger[71]等真菌具有抑制A.flavus生长或产毒的作用。在田间试验中,嗜麦芽黄单胞菌Xanthomonasmaltophila[72]和洋葱假单胞菌P.cepacian[73]分别能够抑制花生和棉籽上A.flavus的生长和AFs的产生。人工接种黄曲霉(菌株GIM3.17)的盆栽花生在收获前使用绿色木霉Trichodermaviride发酵液灌根,土壤中黄曲霉孢子数量降低97%[74]。酿酒酵母Saccharomycescerevisiae通过生物吸附作用可部分清除AFB1[75],平菇Pleurotusostreatus[76]除了抑制黄曲霉的生长,其分泌的胞外酶能够降解稻草和玉米芯的AFB1[77]。目前筛选出的绝大多数生防菌都处在实验室研究阶段,多为农作物上的报道,由于中药材药效成分的特殊性,距离生产应用还有较长的路要走。

4.2 规范加工工艺

在中药材成为药品之前,往往需要经过独特、复杂的加工工艺,开放式的加工环境和繁长的加工过程是造成中药材AFs污染的重要原因。常见的果实种子类药材加工工序包括分拣、洗涤、揉撞、干燥、脱皮、碾磨等。调研发现,新鲜药材采收后经常存在晾晒不及时的现象,例如酸枣采收后需经过一段时间堆沤去除果肉,再开始酸枣仁的加工,高含水量的酸枣以及相对密封的存放环境极易导致霉菌的滋生及毒素的积累;另一方面,中药材产地加工环境和条件受加工户、药材企业自身条件的限制,加工设施不齐全,防晒、防雨、防鼠虫等设施不完整,以及加工过程中使用的水质不清洁,常常会引发霉变,造成中药材的严重污染[78-79]。因此,规范药材产地初加工工艺,例如鲜品除杂、清除病害部位、药材分级等,饮片加工使用清洁流动水、快速烘干等,是从源头上防止药材AFs污染的关键措施。

4.3 加强贮藏管理

通过控制环境温、湿度,改善贮藏条件,同时控制药材含水量是目前中药贮藏过程中最常见和实用的抑制霉菌方法。Zhao等[80]采用中心复合设计-响应面法研究储藏温度和湿度对益智仁中AFs积累的影响,结果显示,在温度低于25℃,相对湿度低于85%时AFs污染水平最低。陈建茹等[81]通过测定不同储藏条件下柏子仁的AFs检出量,给出柏子仁在10、25℃时采用塑料袋及真空包装储藏期不宜超过1个月的建议。《中国药典》(2020年)中规定的药材及饮片的贮藏条件一般描述为“置通风干燥处,防蛀”[5],而水分含量的检查仅对部分药材种类有规定。目前,在贮藏条件的选择上,粮食和食品通常储存于污染菌生长的临界温度、含水量或水活度以下。临界控制点的设置多通过数学模型进行,模拟的参数通常为影响真菌生长的环境及寄主内在因素。目前,在农产品[82]、食品[83]、坚果类[84]等基质中产毒菌生长和产毒的模拟研究较为成熟,在中药材上还少有应用,由于中药材成分组成方面的独特性,建立中药材基质上产毒菌生长和产毒的模型,可以为中药材科学合理的贮藏规范提供理论依据。

5 展望

果实种子类药材中包含很多药食两用的产品,人群的日常摄入量大,以往的研究报道表明AFs污染情况不容乐观,势必导致药品的安全性、有效性受到严重威胁,已引起业内的高度重视。主要AFs的污染菌为黄曲霉和寄生曲霉,研究发现污染菌群中AFs产毒菌株的比例虽然不高,但AFs污染仍然很严重,产毒菌群的生存及产毒机制值得深入探讨。我国从2010版《中国药典》开始规定AFs限量,在中药行业对污染的认识及控制起到极大的推动作用,如陈皮、胖大海在2010之前报道检出量较高,之后污染情况得到明显控制。另外,砂仁、补骨脂、枸杞子虽然目前还没有AFs限量标准,但已有报道表明AFs检出量超出10 μg/kg的情况,在今后应重点关注。国际上已有多个国家药典对果实种子类药材的AFs限量进行规定,随着中药国际贸易量的增加,标准会更加严格,对我国尚未建立标准的药材需引起充分重视。

大部分果实种子类中药材实现了人工种植,如大枣、陈皮、薏苡仁、莲子、麦芽等,这些药材产地来源较为清晰,药材加工工艺相对简单,质量基本能达到稳定可控。但是有些来源于野生的药材,如柏子仁、酸枣仁,产地多且各地采收时间存在差别,农户采收时存在“抢青”现象,原材料成熟度不一致,加工出的药材质量参差不一,AFs的检出率与检出量均较高,防控的关键要按照产地、成熟度、批次等进行分类加工。加工过程的防控可以通过材料的快速干燥、分级筛选、去皮脱除表面霉变层及毒素等物理方法,而通过吸附、化学脱除、生物抑制等农产品及饲料加工上应用的技术,是否适用于中药材还有待探讨,在实际应用时存在一定的局限性。在“十三五”期间,我国在甘肃陇西、山西平顺等多个中药材主产地建立了大型中药材仓储物流基地,实现了环境清洁、温湿度可控的现代中药材仓储,显著提升了中药材安全的保障水平。另外,从来源丰富、无残留、低成本的植物中开发天然防霉剂,如山苍子油等[85],用于中小型仓储也取得了很多研究成果,将有抑菌作用的精油制成微囊、缓释片、气雾剂等剂型,不仅能达到缓释或控释的长效防霉效果,也便于实际操作,具有广阔的应用前景。